Руй Хуан, Бо Сюй
Центр исследований и разработок приложений
Введение
Пептид — это соединение, состоящее из аминокислот, каждая из которых обладает уникальными физическими и химическими свойствами благодаря разным типам и порядку аминокислотных остатков, составляющих ее последовательность.С развитием твердофазного химического синтеза химический синтез различных активных пептидов достиг большого прогресса.Однако из-за сложного состава пептида, полученного твердофазным синтезом, конечный продукт необходимо очищать надежными методами разделения.Обычно используемые методы очистки пептидов включают ионообменную хроматографию (ИЭК) и высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенной фазой (ОФ-ВЭЖХ), недостатки которых заключаются в низкой емкости загрузки образца, высокой стоимости разделяющей среды, сложном и дорогостоящем оборудовании для разделения. и т. д. Для быстрой очистки низкомолекулярных пептидов (ММ < 1 кДа) компания Santai Technologies ранее опубликовала успешный пример применения, в котором картридж SepaFlash RP C18 использовался для быстрой очистки тимопентина (TP-5) и Получен целевой продукт, отвечающий предъявляемым требованиям.
Рисунок 1. 20 распространенных аминокислот (воспроизведено с сайта www.bachem.com).
В составе пептидов часто встречаются 20 видов аминокислот.Эти аминокислоты можно разделить на следующие группы в зависимости от их полярности и кислотно-основных свойств: неполярные (гидрофобные), полярные (незаряженные), кислые или основные (как показано на рисунке 1).Если в пептидной последовательности аминокислоты, составляющие последовательность, в основном полярные (как отмечены розовым цветом на рисунке 1), такие как цистеин, глутамин, аспарагин, серин, треонин, тирозин и т. д., то этот пептид может иметь сильную полярности и хорошо растворимы в воде.Во время процедуры очистки этих сильнополярных пептидных образцов с помощью обращенно-фазовой хроматографии произойдет явление, называемое коллапсом гидрофобной фазы (см. ранее опубликованные примечания по применению Santai Technologies: Коллапс гидрофобной фазы, колонки для обращенно-фазовой хроматографии AQ и их применение).По сравнению с обычными колонками C18 улучшенные колонки C18AQ наиболее подходят для очистки сильнополярных или гидрофильных образцов.В этом посте в качестве образца использовался сильный полярный пептид, который очищался на колонке C18AQ.В результате был получен целевой продукт, отвечающий предъявляемым требованиям, который может быть использован в последующих исследованиях и разработках.
| Инструмент | СепаБин™машина 2 | |||
| Картриджи | 12 г флэш-картриджа SepaFlash C18 RP (сферический диоксид кремния, 20–45 мкм, 100 Å, номер заказа: SW-5222-012-SP) | 12 г флэш-картриджа SepaFlash C18AQ RP (сферический диоксид кремния, 20–45 мкм, 100 Å, номер заказа: SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Длина волны | 254 нм, 220 нм | 214 нм | ||
| Мобильная фаза | Растворитель А: Вода Растворитель Б: Ацетонитрил | |||
| Скорость потока | 15 мл/мин | 20 мл/мин | ||
| Образец загрузки | 30 мг | |||
| Градиент | Время (резюме) | Растворитель Б (%) | Время (мин) | Растворитель Б (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10,0 | 6 | 7,5 | 18 | |
| 12,5 | 6 | 13,0 | 18 | |
| 16,5 | 10 | 14,0 | 22 | |
| 19,0 | 41 | 15,5 | 22 | |
| 21,0 | 41 | 18,0 | 38 | |
| / | / | 20,0 | 38 | |
| 22,0 | 87 | |||
| 29,0 | 87 | |||
Результаты и обсуждение
Чтобы сравнить эффективность очистки образца полярного пептида между обычной колонкой C18 и колонкой C18AQ, мы использовали обычную колонку C18 для мгновенной очистки образца в качестве начала.Как показано на рисунке 2, из-за гидрофобного фазового коллапса цепей C18, вызванного высоким содержанием воды, образец едва удерживался на обычном картридже C18 и непосредственно элюировался подвижной фазой.В результате образец не был эффективно разделен и очищен.
Рисунок 2. Флеш-хроматограмма образца на обычном картридже С18.
Затем мы использовали колонку C18AQ для мгновенной очистки образца.Как показано на рисунке 3, пептид эффективно удерживался на колонке, а затем элюировался.Целевой продукт отделяли от примесей в необработанной пробе и собирали.После лиофилизации и последующего анализа с помощью ВЭЖХ очищенный продукт имеет чистоту 98,2% и может быть в дальнейшем использован для дальнейших исследований и разработок.
Рисунок 3. Флэш-хроматограмма образца на картридже C18AQ.
В заключение, флэш-картридж SepaFlash C18AQ RP в сочетании с системой флэш-хроматографии SepaBean.™Машина может предложить быстрое и эффективное решение для очистки сильнополярных или гидрофильных образцов.
Компания Santai Technology предлагает серию флэш-картриджей SepaFlash C18AQ RP с различными характеристиками (как показано в Таблице 2).
| Номер предмета | Размер столбца | Скорость потока (мл/мин) | Макс.давление (фунты на квадратный дюйм/бар) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 г | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 г | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 г | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 г | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 г | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 г | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 г | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 г | 40-80 | 250/17,2 |
Таблица 2. Флэш-картриджи SepaFlash C18AQ RP.Упаковочные материалы: Высокоэффективный сферический диоксид кремния, связанный C18(AQ), 20–45 мкм, 100 Å.
Для получения дополнительной информации о подробных характеристиках устройства SepaBean™ или информации для заказа флэш-картриджей серии SepaFlash посетите наш веб-сайт.
Время публикации: 12 октября 2018 г.