Rui Huang, Bo Xu
Centrum badawczo-rozwojowe aplikacji
Wstęp
Peptyd to związek złożony z aminokwasów, z których każdy ma unikalne właściwości fizyczne i chemiczne ze względu na inny rodzaj i kolejność reszt aminokwasowych tworzących jego sekwencję.Wraz z rozwojem syntezy chemicznej w fazie stałej, synteza chemiczna różnych aktywnych peptydów poczyniła ogromne postępy.Jednakże ze względu na skomplikowany skład peptydu otrzymywanego metodą syntezy w fazie stałej, produkt końcowy powinien zostać oczyszczony niezawodnymi metodami separacji.Powszechnie stosowane metody oczyszczania peptydów obejmują chromatografię jonowymienną (IEC) i wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconymi fazami (RP-HPLC), których wadami jest mała pojemność ładowania próbki, wysoki koszt mediów rozdzielających, skomplikowany i kosztowny sprzęt do rozdzielania, itp. Do szybkiego oczyszczania peptydów małocząsteczkowych (MW < 1 kDa) firma Santai Technologies opublikowała wcześniej udany przypadek zastosowania, w którym wykorzystano wkład SepaFlash RP C18 do szybkiego oczyszczania tymopentyny (TP-5) i uzyskano docelowy produkt spełniający wymagania.
Rycina 1. 20 popularnych aminokwasów (reprodukcja z www.bachem.com).
Istnieje 20 rodzajów aminokwasów, które są powszechne w składzie peptydów.Aminokwasy te można podzielić na następujące grupy w zależności od ich polarności i właściwości kwasowo-zasadowych: niepolarne (hydrofobowe), polarne (nienaładowane), kwasowe lub zasadowe (jak pokazano na rysunku 1).W sekwencji peptydowej, jeśli aminokwasy tworzące sekwencję są w większości polarne (zaznaczone różowym kolorem na rycinie 1), takie jak cysteina, glutamina, asparagina, seryna, treonina, tyrozyna itp., wówczas peptyd ten może mieć silne działanie polarności i jest dobrze rozpuszczalny w wodzie.Podczas procedury oczyszczania próbek silnie polarnych peptydów za pomocą chromatografii z odwróconymi fazami wystąpi zjawisko zwane zapadnięciem się fazy hydrofobowej (patrz wcześniej opublikowana nota aplikacyjna firmy Santai Technologies: Hydrofobowe załamanie fazy, AQ Reversed Phase Chromatography Columns i ich zastosowania).W porównaniu ze zwykłymi kolumnami C18, ulepszone kolumny C18AQ są najbardziej odpowiednie do oczyszczania próbek silnie polarnych lub hydrofilowych.W tym poście jako próbkę wykorzystano silny peptyd polarny i oczyszczono go na kolumnie C18AQ.W efekcie uzyskano docelowy produkt spełniający stawiane wymagania, który mógł być wykorzystany w dalszych pracach badawczo-rozwojowych.
| Instrument | SepaBean™maszyna 2 | |||
| Wkłady | Kartridż flash SepaFlash C18 RP 12 g (krzemionka sferyczna, 20 - 45 μm, 100 Å, numer zamówienia: SW-5222-012-SP) | Kartridż flash SepaFlash C18AQ RP 12 g (krzemionka sferyczna, 20 - 45 μm, 100 Å, numer zamówienia: SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Długość fali | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Faza mobilna | Rozpuszczalnik A: Woda Rozpuszczalnik B: Acetonitryl | |||
| Przepływ | 15 ml/min | 20 ml/min | ||
| Ładowanie próbki | 30 mg | |||
| Gradient | Czas (CV) | Rozpuszczalnik B (%) | Czas (min) | Rozpuszczalnik B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1,0 | 0 | 1,0 | 4 | |
| 10,0 | 6 | 7,5 | 18 | |
| 12,5 | 6 | 13,0 | 18 | |
| 16,5 | 10 | 14,0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15,5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29,0 | 87 | |||
Wyniki i dyskusja
Aby porównać skuteczność oczyszczania próbki peptydu polarnego pomiędzy zwykłą kolumną C18 i kolumną C18AQ, na początek wykorzystaliśmy zwykłą kolumnę C18 do błyskawicznego oczyszczania próbki.Jak pokazano na rysunku 2, z powodu zapadnięcia się fazy hydrofobowej w łańcuchach C18 spowodowanego wysokim stosunkiem wody, próbka ledwo zatrzymywała się na zwykłym kartridżu C18 i była bezpośrednio eluowana przez fazę ruchomą.W rezultacie próbka nie została skutecznie oddzielona i oczyszczona.
Rysunek 2. Chromatogram typu flash próbki na zwykłym kartridżu C18.
Następnie użyliśmy kolumny C18AQ do błyskawicznego oczyszczania próbki.Jak pokazano na Figurze 3, peptyd skutecznie zatrzymano na kolumnie, a następnie wyeluowano.Produkt docelowy oddzielono od zanieczyszczeń w surowej próbce i zebrano.Po liofilizacji, a następnie analizie metodą HPLC, oczyszczony produkt ma czystość 98,2% i może być dalej wykorzystywany do dalszych etapów badań i rozwoju.
Rysunek 3. Chromatogram typu flash próbki na wkładzie C18AQ.
Podsumowując, kartridż flash SepaFlash C18AQ RP w połączeniu z systemem chromatografii flash SepaBean™maszyna może zaoferować szybkie i skuteczne rozwiązanie do oczyszczania silnie polarnych lub hydrofilowych próbek.
Istnieje seria wkładów flash SepaFlash C18AQ RP o różnych specyfikacjach firmy Santai Technology (jak pokazano w tabeli 2).
| Numer przedmiotu | Rozmiar kolumny | Przepływ (ml/min) | Maks. ciśnienie (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 gr | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 gr | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 gr | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 gr | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 gr | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 gr | 40-80 | 250/17,2 |
Tabela 2. Kartridże flash SepaFlash C18AQ RP.Materiały opakowaniowe: Wysokowydajna sferyczna krzemionka związana C18(AQ), 20 - 45 μm, 100 Å.
Dalsze informacje na temat szczegółowych specyfikacji maszyny SepaBean™ lub informacje dotyczące zamawiania kartridży flash z serii SepaFlash można znaleźć na naszej stronie internetowej.
Czas publikacji: 12 października 2018 r