Rui Huang, Bo Xu
Alkalmazási K+F Központ
Bevezetés
A peptid aminosavakból álló vegyület, amelyek mindegyike egyedi fizikai és kémiai tulajdonságokkal rendelkezik a szekvenciáját alkotó aminosavak különböző típusai és sorrendje miatt.A szilárd fázisú kémiai szintézis kifejlesztésével a különféle aktív peptidek kémiai szintézise nagy előrehaladást ért el.A szilárd fázisú szintézissel nyert peptid bonyolult összetétele miatt azonban a végterméket megbízható elválasztási módszerekkel kell tisztítani.A peptidek általánosan használt tisztítási módszerei közé tartozik az ioncserélő kromatográfia (IEC) és a fordított fázisú nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (RP-HPLC), amelyek hátrányai az alacsony mintabetöltő kapacitás, az elválasztóközeg magas költsége, a bonyolult és költséges elválasztóberendezés, stb. Kis molekulájú peptidek (MW < 1 kDa) gyors tisztítására a Santai Technologies korábban publikált egy sikeres alkalmazási esetet, amelyben SepaFlash RP C18 patront használtak a timopentin (TP-5) gyors tisztítására és a követelményeknek megfelelő célterméket kaptunk.
1. ábra: 20 általános aminosav (a www.bachem.com webhelyről reprodukálva).
A peptidek összetételében 20 féle aminosav található.Ezek az aminosavak polaritásuk és sav-bázis tulajdonságuk szerint a következő csoportokba sorolhatók: nem poláris (hidrofób), poláris (töltésmentes), savas vagy bázikus (ahogy az 1. ábrán látható).Egy peptidszekvenciában, ha a szekvenciát alkotó aminosavak többnyire polárisak (az 1. ábrán rózsaszínnel jelöltük), mint például cisztein, glutamin, aszparagin, szerin, treonin, tirozin stb., akkor ennek a peptidnek erős lehet polaritású, és vízben jól oldódik.Az erős poláris peptidminták fordított fázisú kromatográfiás tisztítási eljárása során egy hidrofób fázis összeomlásnak nevezett jelenség lép fel (lásd a Santai Technologies korábban közzétett alkalmazási megjegyzését: Hydrophobi Phase Collapse, AQ Reversed Phase Chromatography Columns and Their Applications).A hagyományos C18 oszlopokhoz képest a továbbfejlesztett C18AQ oszlopok a legalkalmasabbak erős poláris vagy hidrofil minták tisztítására.Ebben a bejegyzésben egy erős poláris peptidet használtunk mintaként, és C18AQ oszlopon tisztítottuk.Ennek eredményeként a követelményeknek megfelelő célterméket kaptuk, amely felhasználható volt a következő kutatás-fejlesztésben.
| Hangszer | SepaBean™gép 2 | |||
| Patronok | 12 g-os SepaFlash C18 RP vakupatron (gömb alakú szilícium-dioxid, 20-45 μm, 100 Å, rendelési szám: SW-5222-012-SP) | 12 g-os SepaFlash C18AQ RP vakupatron (gömb alakú szilícium-dioxid, 20-45 μm, 100 Å, rendelési szám: SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Hullámhossz | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Mobil fázis | A oldószer: víz B oldószer: acetonitril | |||
| Áramlási sebesség | 15 ml/perc | 20 ml/perc | ||
| Minta betöltés | 30 mg | |||
| Gradiens | Idő (CV) | B oldószer (%) | Idő (perc) | B oldószer (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29.0 | 87 | |||
Eredmények és megbeszélés
A poláris peptidminta tisztítási teljesítményének összehasonlításához a normál C18 oszlop és a C18AQ oszlop között, egy normál C18 oszlopot használtunk a minta gyors tisztítására kiindulásként.Amint a 2. ábrán látható, a C18-láncok hidrofób fázis-összeomlása miatt, amelyet a nagy vizes arány okoz, a minta alig maradt vissza a normál C18-kazettán, és a mozgófázis közvetlenül eluálta.Ennek eredményeként a mintát nem választották el és tisztították hatékonyan.
2. ábra: A minta flash kromatogramja normál C18 kazettán.
Ezután C18AQ oszlopot használtunk a minta gyors tisztítására.A 3. ábrán látható módon a peptid hatékonyan megmaradt az oszlopon, majd eluálódott.A célterméket elválasztottuk a nyers mintában lévő szennyeződésektől és összegyűjtöttük.Liofilizálást követően, majd HPLC-vel analizáltuk, a tisztított termék tisztasága 98,2%, és tovább használható a következő kutatási és fejlesztési lépésekben.
3. ábra. A minta flash kromatogramja C18AQ kazettán.
Összefoglalva, a SepaFlash C18AQ RP flash kazetta a SepaBean flash kromatográfiás rendszerrel kombinálva™A gép gyors és hatékony megoldást kínálhat erős poláris vagy hidrofil minták tisztítására.
A SepaFlash C18AQ RP vakupatronok sorozata a Santai Technologytól eltérő specifikációkkal rendelkezik (lásd a 2. táblázatot).
| Cikkszám | Oszlopméret | Áramlási sebesség (ml/perc) | Max. Nyomás (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
2. táblázat: SepaFlash C18AQ RP vakupatronok.Csomagolóanyagok: Nagy hatékonyságú gömb alakú C18(AQ)-kötésű szilícium-dioxid, 20 - 45 μm, 100 Å.
A SepaBean™ gép részletes specifikációival kapcsolatos további információkért, vagy a SepaFlash sorozatú vakupatronok rendelési információiért látogasson el weboldalunkra.
Feladás időpontja: 2018.10.12