Rui Huang, Bo Xu
Rakenduste uurimis- ja arenduskeskus
Sissejuhatus
Peptiid on ühend, mis koosneb aminohapetest, millest igaühel on unikaalsed füüsikalised ja keemilised omadused, mis tulenevad aminohappejääkide eri tüüpidest ja järjestusest, mis moodustavad selle järjestuse.Tahkefaasilise keemilise sünteesi arendamisega on erinevate aktiivsete peptiidide keemiline süntees teinud suuri edusamme.Kuid tahkefaasilise sünteesiga saadud peptiidi keerulise koostise tõttu tuleks lõppprodukti puhastada usaldusväärsete eraldamismeetoditega.Tavaliselt kasutatavad peptiidide puhastusmeetodid hõlmavad ioonivahetuskromatograafiat (IEC) ja pöördfaasilist kõrgefektiivset vedelikkromatograafiat (RP-HPLC), mille puuduseks on madal proovide laadimisvõime, eralduskeskkonna kõrge hind, keerukad ja kulukad eraldusseadmed, jne. Väikemolekuliliste peptiidide (MW < 1 kDa) kiireks puhastamiseks avaldas Santai Technologies varem eduka rakendusjuhtumi, milles kasutati tümopentiini (TP-5) kiireks puhastamiseks SepaFlash RP C18 kassetti. saadi nõuetele vastav sihttoode.
Joonis 1. 20 tavalist aminohapet (esitatud saidilt www.bachem.com).
Peptiidide koostises on levinud 20 tüüpi aminohappeid.Need aminohapped võib nende polaarsuse ja happe-aluse omaduse järgi jagada järgmistesse rühmadesse: mittepolaarsed (hüdrofoobsed), polaarsed (laenguta), happelised või aluselised (nagu on näidatud joonisel 1).Kui peptiidjärjestuses on järjestuse moodustavad enamasti polaarsed aminohapped (nagu joonisel 1 roosa värviga tähistatud), näiteks tsüsteiin, glutamiin, asparagiin, seriin, treoniin, türosiin jne, võib sellel peptiidil olla tugev polaarsus ja vees hästi lahustuv.Nende tugevate polaarsete peptiidide proovide puhastamise käigus pöördfaasikromatograafiaga ilmneb nähtus, mida nimetatakse hüdrofoobse faasi kollapsiks (vt Santai Technologiesi varem avaldatud rakenduse märkust: hüdrofoobse faasi kokkuvarisemine, AQ pöördfaasikromatograafia kolonnid ja nende rakendused).Võrreldes tavaliste C18 kolonnidega on täiustatud C18AQ kolonnid kõige sobivamad tugevate polaarsete või hüdrofiilsete proovide puhastamiseks.Selles postituses kasutati proovina tugevat polaarset peptiidi ja puhastati C18AQ kolonniga.Selle tulemusena saadi nõuetele vastav sihttoode, mida sai kasutada järgnevas uurimis- ja arendustegevuses.
| Instrument | SepaBean™masin 2 | |||
| Kassetid | 12 g SepaFlash C18 RP välgukassett (sfääriline ränidioksiid, 20–45 μm, 100 Å, tellimisnumber: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP välklambi kassett (sfääriline ränidioksiid, 20–45 μm, 100 Å, tellimisnumber: SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Lainepikkus | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Mobiilne faas | Lahusti A: vesi Lahusti B: atsetonitriil | |||
| Voolukiirus | 15 ml/min | 20 ml/min | ||
| Proovi laadimine | 30 mg | |||
| Gradient | Aeg (CV) | Lahusti B (%) | Aeg (min) | Lahusti B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29.0 | 87 | |||
Tulemused ja arutlus
Polaarse peptiidi proovi puhastustulemuse võrdlemiseks tavalise C18 kolonni ja C18AQ kolonni vahel kasutasime proovi kiirpuhastamiseks tavalist C18 kolonni.Nagu on näidatud joonisel fig 2, jäi proov C18 ahelate hüdrofoobse faasi kokkuvarisemise tõttu, mis oli põhjustatud suurest veesuhtest, vaevu tavalises C18 kassetis ja elueeriti liikuva faasi poolt otse välja.Selle tulemusena ei eraldatud proovi tõhusalt ega puhastatud.
Joonis 2. Proovi kiirkromatogramm tavalisel C18 padrunil.
Järgmisena kasutasime proovi kiirpuhastamiseks C18AQ kolonni.Nagu on näidatud joonisel 3, jäi peptiid tõhusalt kolonnile ja elueeriti seejärel välja.Sihtprodukt eraldati toorproovis olevatest lisanditest ja koguti.Pärast lüofiliseerimist ja seejärel HPLC-ga analüüsimist on puhastatud toote puhtus 98,2% ja seda saab edasi kasutada järgmises uurimis- ja arendustegevuses.
Joonis 3. Proovi kiirkromatogramm C18AQ kassetil.
Kokkuvõtteks võib öelda, et SepaFlash C18AQ RP välklambi kassett kombineerituna kiirkromatograafiasüsteemiga SepaBean™masin võib pakkuda kiiret ja tõhusat lahendust tugevate polaarsete või hüdrofiilsete proovide puhastamiseks.
Santai Technology eri spetsifikatsioonidega SepaFlash C18AQ RP-välklampide seeriat on saadaval (nagu on näidatud tabelis 2).
| Eseme number | Veeru suurus | Voolukiirus (ml/min) | Maksimaalne rõhk (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17,2 |
Tabel 2. SepaFlash C18AQ RP välklambikassetid.Pakkematerjalid: ülitõhus sfääriline C18(AQ)-seotud ränidioksiid, 20 - 45 μm, 100 Å.
Lisateabe saamiseks SepaBean™ masina üksikasjalike spetsifikatsioonide või SepaFlash-seeria välklampide tellimisteabe saamiseks külastage meie veebisaiti.
Postitusaeg: okt-12-2018