Rui Huang, Bo Xu
Centrum výskumu a vývoja aplikácií
Úvod
Peptid je zlúčenina zložená z aminokyselín, z ktorých každá má jedinečné fyzikálne a chemické vlastnosti v dôsledku rôznych typov a poradia aminokyselinových zvyškov tvoriacich jej sekvenciu.S rozvojom chemickej syntézy na pevnej fáze dosiahla chemická syntéza rôznych aktívnych peptidov veľký pokrok.Avšak vzhľadom na komplikované zloženie peptidu získaného syntézou na pevnej fáze by mal byť konečný produkt purifikovaný spoľahlivými separačnými metódami.Medzi bežne používané metódy čistenia peptidov patrí iónomeničová chromatografia (IEC) a vysokoúčinná kvapalinová chromatografia s reverznou fázou (RP-HPLC), ktoré majú nevýhody v nízkej kapacite vzorky, vysokej cene separačných médií, komplikovanom a nákladnom separačnom zariadení, atď. Na rýchlu purifikáciu peptidov s malými molekulami (MW < 1 kDa) bol predtým publikovaný úspešný prípad aplikácie spoločnosťou Santai Technologies, v ktorej bola kazeta SepaFlash RP C18 použitá na rýchlu purifikáciu tymopentinu (TP-5) a bol získaný cieľový produkt spĺňajúci požiadavky.
Obrázok 1. 20 bežných aminokyselín (reprodukované z www.bachem.com).
Existuje 20 druhov aminokyselín, ktoré sú bežné v zložení peptidov.Tieto aminokyseliny možno rozdeliť do nasledujúcich skupín podľa ich polarity a acidobázickej vlastnosti: nepolárne (hydrofóbne), polárne (nenabité), kyslé alebo zásadité (ako je znázornené na obrázku 1).Ak sú v peptidovej sekvencii aminokyseliny tvoriace sekvenciu väčšinou polárne (ako je na obrázku 1 označené ružovou farbou), ako je cysteín, glutamín, asparagín, serín, treonín, tyrozín atď., potom môže mať tento peptid silný polaritu a sú vysoko rozpustné vo vode.Počas purifikačného postupu pre tieto vzorky silných polárnych peptidov pomocou chromatografie na reverznej fáze dôjde k javu nazývanému kolaps hydrofóbnej fázy (pozri predtým publikovanú aplikačnú poznámku od Santai Technologies: Hydrofóbny fázový kolaps, AQ kolóny pre chromatografiu s reverznou fázou a ich aplikácie).V porovnaní s bežnými kolónami C18 sú vylepšené kolóny C18AQ najvhodnejšie na čistenie silných polárnych alebo hydrofilných vzoriek.V tomto príspevku bol ako vzorka použitý silný polárny peptid a purifikovaný pomocou kolóny C18AQ.V dôsledku toho bol získaný cieľový produkt spĺňajúci požiadavky a mohol byť použitý v nasledujúcom výskume a vývoji.
| nástroj | SepaBean™stroj 2 | |||
| Kazety | 12 g blesková kazeta SepaFlash C18 RP (guľovitý oxid kremičitý, 20 - 45 μm, 100 Å, Objednávacie číslo: SW-5222-012-SP) | 12 g blesková kazeta SepaFlash C18AQ RP (guľovitý oxid kremičitý, 20 - 45 μm, 100 Å, objednávacie číslo：SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Vlnová dĺžka | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Mobilná fáza | Rozpúšťadlo A: Voda Rozpúšťadlo B: acetonitril | |||
| Prietok | 15 ml/min | 20 ml/min | ||
| Načítanie vzorky | 30 mg | |||
| Gradient | čas (CV) | Rozpúšťadlo B (%) | čas (min) | Rozpúšťadlo B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1,0 | 0 | 1,0 | 4 | |
| 10,0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13,0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29,0 | 87 | |||
Výsledky a diskusia
Na porovnanie účinnosti purifikácie vzorky polárneho peptidu medzi bežnou kolónou C18 a kolónou C18AQ sme ako začiatok použili bežnú kolónu C18 na rýchle čistenie vzorky.Ako je znázornené na obrázku 2, v dôsledku kolapsu hydrofóbnej fázy reťazcov C18 spôsobeného vysokým vodným pomerom sa vzorka sotva zachytila na bežnej kazete C18 a bola priamo eluovaná mobilnou fázou.Výsledkom bolo, že vzorka nebola účinne oddelená a čistená.
Obrázok 2. Bleskový chromatogram vzorky na bežnej kazete C18.
Ďalej sme použili kolónu C18AQ na rýchle čistenie vzorky.Ako je znázornené na obrázku 3, peptid bol účinne zadržaný na kolóne a potom sa eluoval.Cieľový produkt bol oddelený od nečistôt v surovej vzorke a zozbieraný.Po lyofilizácii a následnej analýze pomocou HPLC má vyčistený produkt čistotu 98,2 % a mohol by byť ďalej použitý pre ďalší krok výskumu a vývoja.
Obrázok 3. Bleskový chromatogram vzorky na kazete C18AQ.
Na záver, SepaFlash C18AQ RP flash kazeta kombinovaná s flash chromatografickým systémom SepaBean™stroj by mohol ponúknuť rýchle a efektívne riešenie na čistenie silných polárnych alebo hydrofilných vzoriek.
Existuje séria bleskových kaziet SepaFlash C18AQ RP s rôznymi špecifikáciami od Santai Technology (ako je uvedené v tabuľke 2).
| Číslo položky | Veľkosť stĺpca | Prietok (ml/min) | Maximálny tlak (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabuľka 2. Bleskové kazety SepaFlash C18AQ RP.Obalové materiály: Vysokoúčinný sférický oxid kremičitý C18(AQ), 20 - 45 μm, 100 Å.
Ďalšie informácie o podrobných špecifikáciách zariadenia SepaBean™ alebo informácie o objednávaní kaziet flash série SepaFlash nájdete na našej webovej stránke.
Čas odoslania: 12. októbra 2018