Rui Huang, Bo Xu
Forschungs- und Entwicklungszentrum für Anwendungen
Einführung
Ein Peptid ist eine Verbindung aus Aminosäuren, von denen jede aufgrund der unterschiedlichen Arten und Reihenfolge der Aminosäurereste, aus denen ihre Sequenz besteht, einzigartige physikalische und chemische Eigenschaften aufweist.Mit der Entwicklung der chemischen Festphasensynthese hat die chemische Synthese verschiedener aktiver Peptide große Fortschritte gemacht.Aufgrund der komplizierten Zusammensetzung des durch Festphasensynthese gewonnenen Peptids sollte das Endprodukt jedoch durch zuverlässige Trennmethoden gereinigt werden.Zu den häufig verwendeten Reinigungsmethoden für Peptide gehören die Ionenaustauschchromatographie (IEC) und die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC), die die Nachteile einer geringen Probenbeladungskapazität, hoher Kosten für Trennmedien sowie komplizierter und kostspieliger Trenngeräte aufweisen. usw. Für die schnelle Reinigung kleiner Molekülpeptide (MW < 1 kDa) wurde zuvor von Santai Technologies ein erfolgreicher Anwendungsfall veröffentlicht, bei dem eine SepaFlash RP C18-Kartusche für die schnelle Reinigung von Thymopentin (TP-5) verwendet wurde Es wurde ein Zielprodukt erhalten, das den Anforderungen entspricht.
Abbildung 1. 20 häufig vorkommende Aminosäuren (reproduziert von www.bachem.com).
Es gibt 20 Arten von Aminosäuren, die in der Zusammensetzung von Peptiden häufig vorkommen.Diese Aminosäuren können entsprechend ihrer Polarität und Säure-Base-Eigenschaft in die folgenden Gruppen eingeteilt werden: unpolar (hydrophob), polar (ungeladen), sauer oder basisch (wie in Abbildung 1 dargestellt).Wenn in einer Peptidsequenz die Aminosäuren, aus denen die Sequenz besteht, größtenteils polare Aminosäuren sind (wie in Abbildung 1 in rosa Farbe markiert), wie z. B. Cystein, Glutamin, Asparagin, Serin, Threonin, Tyrosin usw., dann könnte dieses Peptid eine starke Wirkung haben Polarität aufweisen und in Wasser gut löslich sein.Während des Reinigungsverfahrens für diese stark polaren Peptidproben durch Umkehrphasenchromatographie tritt ein Phänomen auf, das als Kollaps der hydrophoben Phase bezeichnet wird (siehe einen zuvor veröffentlichten Anwendungshinweis von Santai Technologies: Hydrophobic Phase Collapse, AQ Reversed Phase Chromatography Columns and Their Applications).Im Vergleich zu den regulären C18-Säulen eignen sich die verbesserten C18AQ-Säulen am besten für die Reinigung stark polarer oder hydrophiler Proben.In diesem Beitrag wurde ein stark polares Peptid als Probe verwendet und über eine C18AQ-Säule gereinigt.Als Ergebnis wurde das Zielprodukt erhalten, das die Anforderungen erfüllte und in der folgenden Forschung und Entwicklung verwendet werden konnte.
| Instrument | SepaBean™Maschine 2 | |||
| Patronen | 12 g SepaFlash C18 RP Blitzkartusche (sphärisches Silikat, 20 - 45 μm, 100 Å, Bestellnummer: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP Blitzkartusche (sphärisches Silikat, 20 - 45 μm, 100 Å, Bestellnummer: SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Wellenlänge | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Mobile Phase | Lösungsmittel A: Wasser Lösungsmittel B: Acetonitril | |||
| Fließrate | 15 ml/min | 20 ml/min | ||
| Laden der Probe | 30 mg | |||
| Gradient | Zeit (Lebenslauf) | Lösungsmittel B (%) | Zeit (Min.) | Lösungsmittel B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1,0 | 0 | 1,0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29.0 | 87 | |||
Resultate und Diskussion
Um die Reinigungsleistung für die polare Peptidprobe zwischen einer regulären C18-Säule und einer C18AQ-Säule zu vergleichen, verwendeten wir zunächst eine reguläre C18-Säule für die Flash-Reinigung der Probe.Wie in Abbildung 2 dargestellt, wurde die Probe aufgrund des durch den hohen Wasseranteil verursachten Zusammenbruchs der hydrophoben Phase der C18-Ketten kaum auf der regulären C18-Kartusche zurückgehalten und direkt von der mobilen Phase eluiert.Infolgedessen wurde die Probe nicht effektiv getrennt und gereinigt.
Abbildung 2. Das Flash-Chromatogramm der Probe auf einer normalen C18-Kartusche.
Als nächstes verwendeten wir eine C18AQ-Säule zur Flash-Reinigung der Probe.Wie in Abbildung 3 dargestellt, wurde das Peptid effektiv auf der Säule zurückgehalten und dann herausgelöst.Das Zielprodukt wurde von den Verunreinigungen in der Rohprobe getrennt und gesammelt.Nach der Lyophilisierung und anschließenden Analyse mittels HPLC weist das gereinigte Produkt eine Reinheit von 98,2 % auf und könnte für den nächsten Forschungs- und Entwicklungsschritt weiterverwendet werden.
Abbildung 3. Das Flash-Chromatogramm der Probe auf einer C18AQ-Kartusche.
Zusammenfassend: SepaFlash C18AQ RP Flash-Kartusche kombiniert mit dem Flash-Chromatographiesystem SepaBean™Maschine könnte eine schnelle und effektive Lösung für die Reinigung stark polarer oder hydrophiler Proben bieten.
Es gibt eine Reihe der SepaFlash C18AQ RP-Blitzmodule mit unterschiedlichen Spezifikationen von Santai Technology (siehe Tabelle 2).
| Artikelnummer | Spaltengröße | Fließrate (ml/min) | Maximaler Druck (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17,2 |
Tabelle 2. SepaFlash C18AQ RP-Blitzkassetten.Packungsmaterialien: Hocheffizientes sphärisches C18(AQ)-gebundenes Siliziumdioxid, 20–45 μm, 100 Å.
Weitere Informationen zu detaillierten Spezifikationen des SepaBean™-Geräts oder Bestellinformationen zu Flash-Cartridges der SepaFlash-Serie finden Sie auf unserer Website.
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 12. Okt. 2018