Rui Huang, Bo Xu
Centrum badawczo-rozwojowe aplikacji
Wstęp
Chromatografia jonowymienna (IEC) to metoda chromatograficzna powszechnie stosowana do oddzielania i oczyszczania związków występujących w postaci jonowej w roztworze.W zależności od różnych stanów ładunku jonów wymiennych, IEC można podzielić na dwa typy: chromatografię kationowymienną i chromatografię anionowymienną.W chromatografii kationowymiennej grupy kwasowe są związane z powierzchnią ośrodka rozdzielającego.Na przykład kwas sulfonowy (-SO3H) jest powszechnie stosowaną grupą w silnej wymianie kationowej (SCX), która dysocjuje H+, a ujemnie naładowana grupa -SO3- może w ten sposób adsorbować inne kationy w roztworze.W chromatografii anionowymiennej grupy alkaliczne są związane z powierzchnią ośrodka rozdzielającego.Na przykład amina czwartorzędowa (-NR3OH, gdzie R oznacza grupę węglowodorową) jest zwykle stosowana w silnej wymianie anionowej (SAX), która dysocjuje OH-, a dodatnio naładowana grupa -N+R3 może adsorbować inne aniony w roztworze, tworząc anion efekt wymiany.
Wśród produktów naturalnych flawonoidy przyciągają uwagę badaczy ze względu na ich rolę w profilaktyce i leczeniu chorób układu krążenia.Ponieważ cząsteczki flawonoidów są kwaśne ze względu na obecność fenolowych grup hydroksylowych, chromatografia jonowymienna jest alternatywną opcją oprócz konwencjonalnej chromatografii w normalnej fazie lub odwróconej fazy do rozdzielania i oczyszczania tych związków kwasowych.W chromatografii typu flash powszechnie stosowanym środkiem rozdzielającym do wymiany jonowej jest matryca z żelu krzemionkowego, w której grupy jonowymienne są związane z jej powierzchnią.Najczęściej stosowanymi trybami wymiany jonowej w chromatografii typu flash są SCX (zwykle grupa kwasu sulfonowego) i SAX (zwykle czwartorzędowa grupa aminowa).We wcześniej opublikowanej nocie aplikacyjnej zatytułowanej „The Application of SepaFlash Strong Cation Exchange Chromatography Columns in the Purification of Alkaline Compounds” firmy Santai Technologies, kolumny SCX zostały wykorzystane do oczyszczania związków alkalicznych.W tym poście jako próbkę wykorzystano mieszaninę standardów obojętnych i kwasowych do zbadania zastosowania kolumn SAX w oczyszczaniu związków kwasowych.
Sekcja Eksperymentalna
Rysunek 1. Schemat ideowy fazy stacjonarnej związanej z powierzchnią ośrodka separacyjnego SAX.
W tym poście zastosowano kolumnę SAX wypełnioną krzemionką związaną aminą czwartorzędową (jak pokazano na rysunku 1).Jako próbkę do oczyszczenia zastosowano mieszaninę Chromonu i kwasu 2,4-dihydroksybenzoesowego (jak pokazano na Figurze 2).Mieszaninę rozpuszczono w metanolu i załadowano na wkład typu flash za pomocą wtryskiwacza.Układ eksperymentalny oczyszczania rzutowego przedstawiono w tabeli 1.
Rysunek 2. Struktura chemiczna dwóch składników mieszaniny próbek.
| Instrument | Maszyna SepaBean™ T | |||||
| Wkłady | Kartridż flash SepaFlash Standard Series 4 g (krzemionka nieregularna, 40 - 63 μm, 60 Å, numer zamówienia: S-5101-0004) | 4 g kartridż flash SepaFlash Bonded Series SAX (nieregularna krzemionka, 40 - 63 μm, 60 Å, numer zamówienia: SW-5001-004-IR) | ||||
| Długość fali | 254 nm (detekcja), 280 nm (monitorowanie) | |||||
| Faza mobilna | Rozpuszczalnik A: N-heksan | |||||
| Rozpuszczalnik B: Octan etylu | ||||||
| Przepływ | 30 ml/min | 20 ml/min | ||||
| Ładowanie próbki | 20 mg (mieszanina składnika A i składnika B) | |||||
| Gradient | Czas (CV) | Rozpuszczalnik B (%) | Czas (CV) | Rozpuszczalnik B (%) | ||
| 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| 1.7 | 12 | 14 | 100 | |||
| 3.7 | 12 | / | / | |||
| 16 | 100 | / | / | |||
| 18 | 100 | / | / | |||
Wyniki i dyskusja
Najpierw mieszaninę próbek rozdzielono za pomocą wkładu typu flash z normalną fazą, wstępnie wypełnionego zwykłą krzemionką.Jak pokazano na rysunku 3, dwa składniki próbki zostały wyeluowane z wkładu jeden po drugim.Następnie do oczyszczenia próbki wykorzystano kartridż flash SAX.Jak pokazano na Figurze 4, kwasowy Składnik B został całkowicie zatrzymany na wkładzie SAX.Obojętny składnik A był stopniowo eluowany z wkładu wraz z elucją fazy ruchomej.
Rysunek 3. Chromatogram typu flash próbki na zwykłym wkładzie z normalną fazą.
Rysunek 4. Chromatogram typu flash próbki na wkładzie SAX.
Porównując rysunki 3 i 4, składnik A ma niespójny kształt szczytu na dwóch różnych wkładach typu flash.Aby potwierdzić, czy pik elucji odpowiada składnikowi, możemy wykorzystać funkcję skanowania pełnej długości fali, która jest wbudowana w oprogramowanie sterujące maszyny SepaBean™.Otwórz dane eksperymentalne dwóch rozdziałów, przeciągnij do linii wskaźnikowej na osi czasu (CV) na chromatogramie do najwyższego punktu i drugiego najwyższego punktu piku elucji odpowiadającego składnikowi A oraz pełnego widma długości fal tych dwóch punkty zostaną automatycznie pokazane poniżej chromatogramu (jak pokazano na Ryc. 5 i Ryc. 6).Porównując dane dotyczące pełnego widma długości fali tych dwóch separacji, Składnik A ma spójne widmo absorpcji w dwóch eksperymentach.Ponieważ składnik A ma niespójny kształt szczytu na dwóch różnych wkładach typu flash, przypuszcza się, że w składniku A występuje specyficzne zanieczyszczenie, które ma różną retencję we wkładzie z fazą normalną i w wkładzie SAX.Dlatego sekwencja elucji jest inna dla składnika A i zanieczyszczeń na tych dwóch wkładach typu flash, co skutkuje niespójnym kształtem piku na chromatogramach.
Rysunek 5. Pełne widmo długości fal Składnika A i zanieczyszczeń oddzielonych wkładem z fazą normalną.
Rysunek 6. Pełne widmo długości fal Składnika A i zanieczyszczeń oddzielonych wkładem SAX.
Jeśli docelowym produktem do pobrania jest obojętny składnik A, zadanie oczyszczania można łatwo wykonać, bezpośrednio używając wkładu SAX do elucji po załadowaniu próbki.Z drugiej strony, jeśli docelowym produktem, który ma zostać zebrany, jest kwaśny składnik B, można zastosować sposób wychwytywania i uwalniania z jedynie niewielką korektą w etapach doświadczalnych: kiedy próbka została załadowana do wkładu SAX, a obojętny składnik A został całkowicie wymyty rozpuszczalnikami organicznymi z normalną fazą, zamienić fazę ruchomą na roztwór metanolu zawierający 5% kwasu octowego.Jony octanowe w fazie ruchomej będą konkurować ze Składnikiem B o wiązanie z grupami jonowymi aminy czwartorzędowej w fazie stacjonarnej wkładu SAX, wymywając w ten sposób Składnik B z wkładu w celu uzyskania produktu docelowego.Chromatogram próbki rozdzielonej w trybie wymiany jonowej przedstawiono na rycinie 7.
Rycina 7. Chromatogram typu flash składnika B eluowanego w trybie wymiany jonowej na wkładzie SAX.
Podsumowując, próbkę kwaśną lub obojętną można szybko oczyścić za pomocą wkładu SAX w połączeniu z wkładem z normalną fazą, stosując różne strategie oczyszczania.Co więcej, za pomocą funkcji skanowania przy pełnej długości fali wbudowanej w oprogramowanie sterujące maszyny SepaBean™, można było łatwo porównać i potwierdzić charakterystyczne widmo absorpcji wymywanych frakcji, pomagając badaczom szybko określić skład i czystość wymywanych frakcji, a tym samym poprawiając efektywność pracy.
| Numer przedmiotu | Rozmiar kolumny | Przepływ (ml/min) | Maks. ciśnienie (psi/bar) |
| SW-5001-004-IR | 5,9 g | 10-20 | 400/27,5 |
| SW-5001-012-IR | 23 gr | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5001-025-IR | 38 gr | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5001-040-IR | 55 gr | 20-40 | 400/27,5 |
| SW-5001-080-IR | 122 gr | 30-60 | 350/24,0 |
| SW-5001-120-IR | 180 gr | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5001-220-IR | 340 gr | 50-100 | 300/20,7 |
| SW-5001-330-IR | 475 gr | 50-100 | 250/17,2
|
Tabela 2. Wkłady flash SepaFlash Bonded Series SAX.Materiały opakowaniowe: Ultraczysta, nieregularna krzemionka związana SAX, 40 - 63 μm, 60 Å.
Więcej informacji na temat szczegółowych specyfikacji SepaBean™urządzenia lub informacje dotyczące zamawiania wkładów flash serii SepaFlash można znaleźć na naszej stronie internetowej.
Czas publikacji: 09 listopada 2018 r