Hongcheng Wang, Bo Xu
ศูนย์ R&D แอปพลิเคชัน
การแนะนำ
ตามขั้วสัมพัทธ์ของเฟสนิ่งและเฟสเคลื่อนที่ โครมาโตกราฟีของเหลวสามารถแบ่งออกเป็นโครมาโตกราฟีแบบเฟสปกติ (NPC) และโครมาโตกราฟีแบบเฟสย้อนกลับ (RPC)สำหรับ RPC ขั้วของเฟสเคลื่อนที่จะแรงกว่าเฟสที่อยู่นิ่งRPC ได้กลายเป็นโหมดที่ใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดในโหมดการแยกด้วยโครมาโตกราฟีแบบของเหลว เนื่องจากมีประสิทธิภาพสูง ความละเอียดดี และกลไกการกักเก็บที่ชัดเจนดังนั้น RPC จึงเหมาะสำหรับการแยกและทำให้บริสุทธิ์ของสารประกอบที่มีขั้วหรือไม่มีขั้วต่างๆ รวมถึงอัลคาลอยด์ คาร์โบไฮเดรต กรดไขมัน สเตียรอยด์ กรดนิวคลีอิก กรดอะมิโน เปปไทด์ โปรตีน ฯลฯ ใน RPC เฟสคงที่ที่ใช้บ่อยที่สุดคือ เมทริกซ์ซิลิกาเจลซึ่งจับกับหมู่ฟังก์ชันต่างๆ ได้แก่ C18, C8, C4, ฟีนิล, ไซยาโน, อะมิโน ฯลฯ ในบรรดาหมู่ฟังก์ชันที่ถูกผูกมัดเหล่านี้ กลุ่มที่ใช้กันอย่างแพร่หลายคือ C18ประมาณว่ามากกว่า 80% ของ RPC กำลังใช้ C18 bonded phaseดังนั้นคอลัมน์โครมาโตกราฟี C18 จึงกลายเป็นคอลัมน์สากลที่ทุกห้องปฏิบัติการต้องมี
แม้ว่าคอลัมน์ C18 จะสามารถใช้งานได้หลากหลาย อย่างไรก็ตาม สำหรับตัวอย่างบางตัวอย่างที่มีขั้วมากหรือชอบน้ำสูง คอลัมน์ C18 ปกติอาจมีปัญหาเมื่อใช้เพื่อทำให้ตัวอย่างดังกล่าวบริสุทธิ์ใน RPC ตัวทำละลายสำหรับชะที่ใช้กันทั่วไปสามารถสั่งซื้อได้ตามความมีขั้ว: น้ำ < เมทานอล < อะซีโตไนไทรล์ < เอทานอล < เตตระไฮโดรฟิวแรน < ไอโซโพรพานอลเพื่อรับประกันการกักเก็บที่ดีในคอลัมน์สำหรับตัวอย่างเหล่านี้ (ขั้วที่แข็งแรงหรือชอบน้ำสูง) จำเป็นต้องใช้ระบบน้ำที่มีสัดส่วนสูงเป็นเฟสเคลื่อนที่อย่างไรก็ตาม เมื่อใช้ระบบน้ำบริสุทธิ์ (รวมถึงน้ำบริสุทธิ์หรือสารละลายเกลือบริสุทธิ์) เป็นเฟสเคลื่อนที่ โซ่คาร์บอนยาวบนเฟสนิ่งของคอลัมน์ C18 มักจะหลีกเลี่ยงน้ำและผสมกันเอง ส่งผลให้ค่าน้ำลดลงทันที ความสามารถในการเก็บรักษาของคอลัมน์หรือแม้กระทั่งไม่มีการเก็บรักษาปรากฏการณ์นี้เรียกว่า “การพังทลายของเฟสที่ไม่ชอบน้ำ” (ดังแสดงในส่วนซ้ายของรูปที่ 1)แม้ว่าสถานการณ์นี้จะย้อนกลับได้เมื่อคอลัมน์ถูกล้างด้วยตัวทำละลายอินทรีย์ เช่น เมทานอลหรืออะซีโตไนไทรล์ แต่ก็ยังสามารถทำให้คอลัมน์เสียหายได้ดังนั้นจึงจำเป็นต้องป้องกันไม่ให้สถานการณ์นี้เกิดขึ้น
รูปที่ 1 แผนผังของเฟสที่ถูกพันธะบนพื้นผิวของซิลิกาเจลในคอลัมน์ C18 ปกติ (ซ้าย) และคอลัมน์ C18AQ (ขวา)
เพื่อแก้ไขปัญหาดังกล่าวข้างต้น ผู้ผลิตวัสดุบรรจุภัณฑ์โครมาโตกราฟีได้ทำการปรับปรุงทางเทคนิคหนึ่งในการปรับปรุงเหล่านี้คือการปรับเปลี่ยนพื้นผิวของซิลิกาเมทริกซ์ เช่น การเพิ่มกลุ่มไซยาโนที่ชอบน้ำ (ดังแสดงในส่วนขวาของรูปที่ 1) เพื่อทำให้พื้นผิวของซิลิกาเจลชอบน้ำมากขึ้นดังนั้นสายโซ่ C18 บนพื้นผิวซิลิกาจึงสามารถขยายออกจนสุดภายใต้สภาวะที่มีน้ำสูง และหลีกเลี่ยงการยุบตัวของเฟสที่ไม่ชอบน้ำได้คอลัมน์ C18 ที่ดัดแปลงเหล่านี้เรียกว่าคอลัมน์ C18 ที่มีน้ำ ซึ่งก็คือคอลัมน์ C18AQ ซึ่งออกแบบมาสำหรับสภาวะการชะที่มีน้ำสูงและสามารถทนต่อระบบที่มีน้ำได้ 100%มีการใช้คอลัมน์ C18AQ กันอย่างแพร่หลายในการแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของสารประกอบที่มีขั้วอย่างแรง รวมถึงกรดอินทรีย์ เปปไทด์ นิวคลีโอไซด์ และวิตามินที่ละลายในน้ำ
การแยกเกลือออกเป็นหนึ่งในการใช้งานทั่วไปของคอลัมน์ C18AQ ในการทำให้บริสุทธิ์แบบแฟลชสำหรับตัวอย่าง ซึ่งจะกำจัดส่วนประกอบของเกลือหรือบัฟเฟอร์ในตัวทำละลายตัวอย่างเพื่ออำนวยความสะดวกในการใช้ตัวอย่างในการศึกษาครั้งต่อไปในโพสต์นี้ ใช้ Brilliant Blue FCF ที่มีขั้วแข็งเป็นตัวอย่างและทำให้บริสุทธิ์ในคอลัมน์ C18AQตัวทำละลายตัวอย่างถูกแทนที่ด้วยตัวทำละลายอินทรีย์จากสารละลายบัฟเฟอร์ ซึ่งช่วยอำนวยความสะดวกในการระเหยแบบหมุนต่อไปนี้ รวมทั้งช่วยประหยัดตัวทำละลายและเวลาในการทำงานนอกจากนี้ ความบริสุทธิ์ของตัวอย่างยังได้รับการปรับปรุงโดยการกำจัดสิ่งเจือปนบางส่วนในตัวอย่าง
ส่วนการทดลอง
รูปที่ 2 โครงสร้างทางเคมีของตัวอย่าง
ใช้ Brilliant Blue FCF เป็นตัวอย่างในโพสต์นี้ความบริสุทธิ์ของตัวอย่างดิบคือ 86% และโครงสร้างทางเคมีของตัวอย่างแสดงในรูปที่ 2 ในการเตรียมสารละลายตัวอย่าง ของแข็งหยาบที่เป็นผง 300 มก. ของ Brilliant Blue FCF ถูกละลายในสารละลายบัฟเฟอร์ 1 M NaH2PO4 และเขย่าให้เข้ากันกลายเป็น ทางออกที่ชัดเจนอย่างสมบูรณ์สารละลายตัวอย่างถูกฉีดเข้าไปในคอลัมน์แฟลชโดยหัวฉีดการตั้งค่าการทดลองของการทำให้บริสุทธิ์แบบแฟลชแสดงอยู่ในตารางที่ 1
| อุปกรณ์ | เครื่อง SepaBean™2 | |||
| ตลับหมึก | ตลับแฟลช SepaFlash C18 RP 12 ก. (ซิลิกาทรงกลม, 20 - 45 μm, 100 Å, หมายเลขสั่งซื้อ: SW-5222-012-SP) | ตลับแฟลช SepaFlash C18AQ RP 12 ก. (ซิลิกาทรงกลม, 20 - 45 μm, 100 Å, หมายเลขใบสั่งซื้อ：SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| ความยาวคลื่น | 254 นาโนเมตร | |||
| เฟสมือถือ | ตัวทำละลาย A：น้ำ ตัวทำละลาย B：เมทานอล | |||
| อัตราการไหล | 30 มล./นาที | |||
| กำลังโหลดตัวอย่าง | 300 มก. (Brilliant Blue FCF ที่มีความบริสุทธิ์ 86%) | |||
| การไล่ระดับสี | เวลา (CV) | ตัวทำละลาย B (%) | เวลา (CV) | ตัวทำละลาย B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 น | 100 | 17.5 น | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
ผลลัพธ์และการอภิปราย
คาร์ทริดจ์แฟลช SepaFlash C18AQ RP ใช้สำหรับการแยกเกลือออกจากตัวอย่างและทำให้บริสุทธิ์ใช้การไล่ระดับสีแบบขั้นโดยใช้น้ำบริสุทธิ์เป็นเฟสเคลื่อนที่เมื่อเริ่มต้นการชะ และเรียกใช้สำหรับปริมาตร 10 คอลัมน์ (CV)ดังแสดงในรูปที่ 3 เมื่อใช้น้ำบริสุทธิ์เป็นเฟสเคลื่อนที่ ตัวอย่างจะคงอยู่ในตลับแฟลชอย่างสมบูรณ์ถัดไป เมทานอลในเฟสเคลื่อนที่เพิ่มขึ้นโดยตรงเป็น 100% และรักษาระดับความชันไว้ที่ 7.5 CVตัวอย่างถูกแยกออกจาก 11.5 ถึง 13.5 CVในเศษส่วนที่รวบรวมได้ สารละลายตัวอย่างถูกแทนที่จากสารละลายบัฟเฟอร์ NaH2PO4 เป็นเมทานอลเมื่อเปรียบเทียบกับสารละลายที่มีน้ำสูง เมทานอลสามารถกำจัดออกได้ง่ายกว่ามากโดยการระเหยแบบหมุนในขั้นตอนต่อมา ซึ่งช่วยอำนวยความสะดวกในการวิจัยต่อไปนี้
รูปที่ 3 แฟลชโครมาโตแกรมของตัวอย่างบนคาร์ทริดจ์ C18AQ
ในการเปรียบเทียบพฤติกรรมการคงอยู่ของคาร์ทริดจ์ C18AQ และคาร์ทริดจ์ C18 ปกติสำหรับตัวอย่างที่มีความเป็นขั้วสูง ได้ทำการทดสอบเปรียบเทียบแบบขนานมีการใช้คาร์ทริดจ์แฟลช SepaFlash C18 RP และโครมาโตแกรมแฟลชสำหรับตัวอย่างแสดงในรูปที่ 4 สำหรับคาร์ทริดจ์ C18 ทั่วไป อัตราส่วนเฟสน้ำที่ยอมรับได้สูงสุดคือประมาณ 90%ดังนั้นจึงตั้งค่าการไล่ระดับสีเริ่มต้นที่เมทานอล 10% ในน้ำ 90%ดังแสดงในรูปที่ 4 เนื่องจากการยุบตัวของเฟสที่ไม่ชอบน้ำของสายโซ่ C18 ที่เกิดจากอัตราส่วนของน้ำที่สูง ตัวอย่างจึงแทบจะไม่ถูกเก็บเอาไว้ในคาร์ทริดจ์ C18 ปกติและถูกชะออกโดยตรงโดยเฟสเคลื่อนที่ส่งผลให้ไม่สามารถดำเนินการแยกเกลือออกจากตัวอย่างหรือทำให้บริสุทธิ์ได้
รูปที่ 4 แฟลชโครมาโตแกรมของตัวอย่างในคาร์ทริดจ์ C18 ปกติ
เมื่อเปรียบเทียบกับการไล่ระดับสีเชิงเส้น การใช้การไล่ระดับสีแบบขั้นมีข้อดีดังต่อไปนี้:
1. การใช้ตัวทำละลายและเวลาที่ใช้ในการทำให้ตัวอย่างบริสุทธิ์ลดลง
2. ผลิตภัณฑ์เป้าหมายจะชะออกในจุดยอดแหลม ซึ่งช่วยลดปริมาตรของเศษส่วนที่รวบรวมได้ และด้วยเหตุนี้จึงช่วยอำนวยความสะดวกในการระเหยแบบหมุนต่อไปนี้ รวมทั้งช่วยประหยัดเวลา
3. ผลิตภัณฑ์ที่รวบรวมได้อยู่ในเมทานอลซึ่งระเหยได้ง่ายทำให้เวลาในการอบแห้งลดลง
โดยสรุป สำหรับการทำให้ตัวอย่างบริสุทธิ์ซึ่งมีขั้วสูงหรือชอบน้ำสูง คาร์ทริดจ์แฟลช SepaFlash C18AQ RP ร่วมกับระบบโครมาโตกราฟีแบบแฟลชสำหรับการเตรียม SepaBean™ Machine สามารถนำเสนอโซลูชันที่รวดเร็วและมีประสิทธิภาพ
เกี่ยวกับตลับแฟลช SepaFlash Bonded Series C18 RP
มีตลับแฟลช SepaFlash C18AQ RP หลายชุดที่มีคุณสมบัติแตกต่างจาก Santai Technology (ดังแสดงในตารางที่ 2)
| หมายเลขรายการ | ขนาดคอลัมน์ | อัตราการไหล (มล./นาที) | แรงดันสูงสุด (ปอนด์/บาร์) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5.4 ก | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 ก | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 ก | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 ก | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 ก | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 ก | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 กรัม | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 ก | 40-80 | 250/17.2 |
ตารางที่ 2. ตลับแฟลช SepaFlash C18AQ RP
วัสดุบรรจุภัณฑ์: ซิลิกา C18(AQ) ทรงกลมประสิทธิภาพสูง, 20 - 45 μm, 100 Å
โลจิสติก (ดังแสดงในตารางที่ 2)
เวลาโพสต์: ส.ค.-27-2561