Hongcheng Wang, Bo Xu
Application R&D Center
Panimula
Ayon sa mga kamag-anak na polaridad ng nakatigil na yugto at bahagi ng mobile, ang likidong chromatography ay maaaring nahahati sa normal na phase chromatography (NPC) at reversed phase chromatography (RPC).Para sa RPC, ang polarity ng mobile phase ay mas malakas kaysa sa stationary phase.Ang RPC ay naging pinakamalawak na ginagamit sa mga mode ng paghihiwalay ng liquid chromatography dahil sa mataas na kahusayan nito, mahusay na resolution at malinaw na mekanismo ng pagpapanatili.Samakatuwid, ang RPC ay angkop para sa paghihiwalay at paglilinis ng iba't ibang polar o non-polar compound, kabilang ang mga alkaloid, carbohydrates, fatty acid, steroid, nucleic acid, amino acid, peptides, protina, atbp. Sa RPC, ang pinakakaraniwang ginagamit na nakatigil na yugto ay ang silica gel matrix na naka-bonding sa iba't ibang functional na grupo, kabilang ang C18, C8, C4, phenyl, cyano, amino, atbp. Kabilang sa mga bonded functional na grupong ito, ang pinakamalawak na ginagamit ay C18.Tinatayang higit sa 80% ng RPC ang gumagamit na ngayon ng C18 bonded phase.Samakatuwid, ang C18 chromatography column ay naging isang kailangang-kailangan na unibersal na column para sa bawat laboratoryo.
Bagama't maaaring gamitin ang column ng C18 sa napakalawak na hanay ng mga aplikasyon, gayunpaman, para sa ilang sample na napakapolar o mataas ang hydrophilic, maaaring magkaroon ng mga problema ang mga regular na column ng C18 kapag ginagamit upang linisin ang mga naturang sample.Sa RPC, ang mga karaniwang ginagamit na elution solvents ay maaaring i-order ayon sa kanilang polarity: tubig < methanol < acetonitrile < ethanol < tetrahydrofuran < isopropanol.Upang matiyak ang mahusay na pagpapanatili sa column para sa mga sample na ito (strong polar o highly hydrophilic), ang mataas na proporsyon ng aqueous system ay kinakailangan upang magamit bilang mobile phase.Gayunpaman, kapag gumagamit ng purong sistema ng tubig (kabilang ang purong tubig o purong solusyon sa asin) bilang mobile phase, ang mahabang carbon chain sa nakatigil na yugto ng column ng C18 ay may posibilidad na maiwasan ang tubig at maghalo sa isa't isa, na nagreresulta sa isang agarang pagbaba sa kapasidad ng pagpapanatili ng column o kahit na walang retention.Ang phenomenon na ito ay tinatawag na "hydrophobic phase collapse" (tulad ng ipinapakita sa kaliwang bahagi ng Figure 1).Bagama't nababaligtad ang sitwasyong ito kapag ang column ay hinugasan ng mga organikong solvent tulad ng methanol o acetonitrile, maaari pa rin itong magdulot ng pinsala sa column.Samakatuwid, ito ay kinakailangan upang maiwasan ang sitwasyong ito na mangyari.
Figure 1. Ang schematic diagram ng bonded phases sa ibabaw ng silica gel sa regular na C18 column (kaliwa) at C18AQ column (kanan).
Upang matugunan ang mga nabanggit na problema, ang mga tagagawa ng chromatographic packing materials ay gumawa ng mga teknikal na pagpapabuti.Ang isa sa mga pagpapahusay na ito ay ang paggawa ng ilang mga pagbabago sa ibabaw ng silica matrix, tulad ng pagpapakilala ng mga hydrophilic cyano group (tulad ng ipinapakita sa kanang bahagi ng Figure 1), upang gawing mas hydrophilic ang ibabaw ng silica gel.Kaya ang mga chain ng C18 sa ibabaw ng silica ay maaaring ganap na mapalawak sa ilalim ng mataas na tubig na mga kondisyon at maiiwasan ang pagbagsak ng hydrophobic phase.Ang binagong C18 na mga column na ito ay tinatawag na aqueous C18 column, katulad ng mga C18AQ column, na idinisenyo para sa mataas na aqueous na mga kondisyon ng elution at kayang tiisin ang 100% aqueous system.Ang mga column ng C18AQ ay malawakang inilapat sa paghihiwalay at paglilinis ng mga malalakas na polar compound, kabilang ang mga organic na acid, peptides, nucleosides at mga bitamina na nalulusaw sa tubig.
Ang desalting ay isa sa mga tipikal na aplikasyon ng mga column ng C18AQ sa flash purification para sa mga sample, na nag-aalis ng mga bahagi ng asin o buffer sa sample solvent upang mapadali ang paggamit ng sample sa mga susunod na pag-aaral.Sa post na ito, ginamit ang Brilliant Blue FCF na may malakas na polarity bilang sample at na-purify sa column na C18AQ.Ang sample na solvent ay pinalitan ng organic solvent mula sa buffer solution, kaya pinapadali ang sumusunod na rotary evaporation pati na rin ang pag-save ng mga solvent at oras ng pagpapatakbo.Higit pa rito, ang kadalisayan ng sample ay napabuti sa pamamagitan ng pag-alis ng ilang mga dumi sa sample.
Seksyon ng Eksperimental
Figure 2. Ang kemikal na istraktura ng sample.
Ginamit ang Brilliant Blue FCF bilang sample sa post na ito.Ang kadalisayan ng hilaw na sample ay 86% at ang kemikal na istraktura ng sample ay ipinakita sa Figure 2. Upang ihanda ang sample solution, 300 mg powdery crude solid ng Brilliant Blue FCF ay natunaw sa 1 M NaH2PO4 buffer solution at inalog mabuti upang maging isang ganap na malinaw na solusyon.Ang sample na solusyon ay pagkatapos ay iniksyon sa flash column ng isang injector.Ang pang-eksperimentong setup ng flash purification ay nakalista sa Talahanayan 1.
| Instrumento | SepaBean™ Machine2 | |||
| Mga Cartridge | 12 g SepaFlash C18 RP flash cartridge (spherical silica, 20 - 45 μm, 100 Å, Numero ng order: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP flash cartridge (spherical silica, 20 - 45 μm, 100 Å, Numero ng order：SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| Haba ng daluyong | 254 nm | |||
| Mobile phase | Solvent A: Tubig Solvent B:Methanol | |||
| Daloy ng rate | 30 mL/min | |||
| Sample loading | 300 mg (Brilliant Blue FCF na may kadalisayan ng 86%) | |||
| Gradient | Oras (CV) | Solvent B (%) | Oras (CV) | Solvent B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Resulta at diskusyon
Isang SepaFlash C18AQ RP flash cartridge ang ginamit para sa sample na desalting at purification.Ginamit ang step gradient kung saan ginamit ang purong tubig bilang mobile phase sa simula ng elution at tumakbo para sa 10 column volumes (CV).Gaya ng ipinapakita sa Figure 3, kapag gumagamit ng purong tubig bilang mobile phase, ang sample ay ganap na nananatili sa flash cartridge.Susunod, ang methanol sa mobile phase ay direktang nadagdagan sa 100% at ang gradient ay pinananatili para sa 7.5 CV.Ang sample ay pinalabas mula 11.5 hanggang 13.5 CV.Sa mga nakolektang fraction, ang sample na solusyon ay pinalitan mula sa NaH2PO4 buffer solution sa methanol.Kung ikukumpara sa mataas na tubig na solusyon, ang methanol ay mas madaling alisin sa pamamagitan ng rotary evaporation sa kasunod na hakbang, na nagpapadali sa sumusunod na pananaliksik.
Figure 3. Ang flash chromatogram ng sample sa isang C18AQ cartridge.
Upang ihambing ang pag-uugali ng pagpapanatili ng C18AQ cartridge at regular na C18 cartridge para sa mga sample ng malakas na polarity, isinagawa ang parallel comparison test.Isang SepaFlash C18 RP flash cartridge ang ginamit at ang flash chromatogram para sa sample ay ipinakita sa Figure 4. Para sa mga regular na C18 cartridge, ang pinakamataas na pinahihintulutang aqueous phase ratio ay humigit-kumulang 90%.Samakatuwid ang start gradient ay itinakda sa 10% methanol sa 90% na tubig.Tulad ng ipinapakita sa Figure 4, dahil sa pagbagsak ng hydrophobic phase ng mga chain ng C18 na sanhi ng mataas na aqueous ratio, ang sample ay halos hindi nananatili sa regular na C18 cartridge at direktang na-eluted ng mobile phase.Bilang resulta, hindi makukumpleto ang operasyon ng sample desalting o purification.
Figure 4. Ang flash chromatogram ng sample sa isang regular na C18 cartridge.
Kung ikukumpara sa linear gradient, ang paggamit ng step gradient ay may mga sumusunod na pakinabang:
1. Nababawasan ang paggamit ng solvent at oras ng pagpapatakbo para sa sample purification.
2. Ang target na produkto ay nag-elute sa isang matalim na peak, na nagpapababa sa dami ng mga nakolektang fraction at sa gayon ay pinapadali ang sumusunod na rotary evaporation pati na rin ang pagtitipid ng oras.
3. Ang nakolektang produkto ay nasa methanol na madaling ma-evaporate, kaya nababawasan ang oras ng pagpapatuyo.
Bilang konklusyon, para sa purification ng sample na malakas ang polar o highly hydrophilic, ang SepaFlash C18AQ RP flash cartridges na pinagsama sa preparative flash chromatography system na SepaBean™ Machine ay maaaring mag-alok ng mabilis at mahusay na solusyon.
Tungkol sa SepaFlash Bonded Series C18 RP flash cartridges
Mayroong isang serye ng mga SepaFlash C18AQ RP flash cartridge na may iba't ibang mga detalye mula sa Santai Technology (tulad ng ipinapakita sa Talahanayan 2).
| Bilang | Laki ng Column | Daloy ng rate (mL/min) | Max.Pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Talahanayan 2. SepaFlash C18AQ RP flash cartridges.
Mga materyales sa pag-iimpake: High-efficiency spherical C18(AQ)-bonded silica, 20 - 45 μm, 100 Å.
logy (tulad ng ipinapakita sa Talahanayan 2).
Oras ng post: Aug-27-2018