Hongcheng Wang, Bo Xu
Applikaasje R&D Sintrum
Ynlieding
Neffens de relative polariteiten fan stasjonêre faze en mobile faze kin floeistofchromatografy wurde ferdield yn normale faze-chromatografy (NPC) en omkearde faze-chromatografy (RPC).Foar RPC is de polariteit fan 'e mobile faze sterker as dy fan' e stasjonêre faze.RPC is de meast brûkte wurden wurden yn skiedingsmodi foar floeistofchromatografy fanwege syn hege effisjinsje, goede resolúsje en dúdlike retinsjemeganisme.Dêrom is RPC geskikt foar de skieding en suvering fan ferskate polêre of net-polêre ferbiningen, ynklusyf alkaloïden, koalhydraten, fatty soeren, steroids, nucleic soeren, aminosoeren, peptiden, aaiwiten, ensfh Yn RPC, de meast brûkte stasjonêre faze is de silikagelmatrix dy't ferbûn is mei ferskate funksjonele groepen, ynklusyf C18, C8, C4, phenyl, cyano, amino, ensfh Under dizze bondele funksjonele groepen is de meast brûkte C18.It wurdt rûsd dat mear dan 80% fan RPC no C18 bonded faze brûke.Dêrom is de C18-chromatografyske kolom in universele kolom wurden wurden foar elk laboratoarium.
Hoewol't C18 kolom kin brûkt wurde yn in hiel breed skala oan tapassings, lykwols, foar guon samples dy't hiel polar of tige hydrophilic, kinne reguliere C18 kolommen hawwe problemen doe't se brûkt te suverjen sokke samples.Yn RPC kinne de meast brûkte elueringssolvents besteld wurde neffens har polariteit: wetter < methanol < acetonitril < ethanol < tetrahydrofuran < isopropanol.Om in goede retinsje op 'e kolom te garandearjen foar dizze samples (sterke poal as heul hydrofil), is in hege oanpart fan wetterich systeem nedich om te wurde brûkt as de mobile faze.By it brûken fan suver wettersysteem (ynklusyf suver wetter of suvere sâltoplossing) as de mobile faze, hat de lange koalstofketen op 'e stasjonêre faze fan C18-kolom de neiging om it wetter te foarkommen en mei elkoar te mingjen, wat resulteart yn in instantane fermindering fan 'e retinsjekapasiteit fan 'e kolom of sels gjin retinsje.Dit ferskynsel wurdt neamd "hydrofobe faze collapse" (lykas werjûn yn it linker diel fan figuer 1).Hoewol dizze situaasje omkearber is as de kolom wurdt wosken mei organyske solvents lykas methanol of acetonitril, kin it noch skea oan 'e kolom feroarsaakje.Dêrom is it needsaaklik om dizze situaasje te foarkommen.
figuer 1. It skematyske diagram fan de bonded fazen op it oerflak fan silica gel yn reguliere C18 kolom (lofts) en C18AQ kolom (rjochts).
Om de hjirboppe neamde problemen oan te pakken, hawwe de fabrikanten fan chromatografyske ferpakkingsmaterialen technyske ferbetterings makke.Ien fan dizze ferbetterings is it meitsjen fan wat wizigingen op it oerflak fan 'e silika-matrix, lykas de ynfiering fan hydrofiele cyanogroepen (lykas werjûn yn' e rjochterkant fan figuer 1), om it oerflak fan 'e silikagel mear hydrofiel te meitsjen.Sa koene de C18-keatlingen op it silika-oerflak folslein útwreide wurde ûnder heul wetterige omstannichheden en koe de hydrofobe faze-ynstoarten wurde foarkommen.Dizze modifisearre C18-kolommen wurde wetterige C18-kolommen neamd, nammentlik C18AQ-kolommen, dy't binne ûntworpen foar tige wetterige elueringsbetingsten en kinne 100% wetterich systeem tolerearje.C18AQ-kolommen binne breed tapast yn 'e skieding en suvering fan sterke polêre ferbiningen, ynklusyf organyske soeren, peptiden, nukleosiden en wetteroplosbere vitaminen.
Desalting is ien fan 'e typyske tapassingen fan C18AQ-kolommen yn' e flitsreiniging foar samples, dy't de sâlt- of bufferkomponinten yn 'e sample-oplosmiddel ferwideret om de tapassing fan' e stekproef yn folgjende stúdzjes te fasilitearjen.Yn dizze post waard de Brilliant Blue FCF mei sterke polariteit brûkt as stekproef en suvere op 'e C18AQ kolom.De sample solvent waard ferfongen troch organyske solvent út buffer oplossing, sa fasilitearje de folgjende rotearjende ferdamping likegoed as besparje solvents en operaasje tiid.Fierder waard de suverens fan 'e stekproef ferbettere troch guon ûnreinheden yn' e stekproef te ferwiderjen.
Eksperimintele seksje
figuer 2. De gemyske struktuer fan it stekproef.
De Brilliant Blue FCF waard brûkt as stekproef yn dizze post.De suverens fan 'e rûge stekproef wie 86% en de gemyske struktuer fan' e stekproef waard werjûn yn figuer 2. Om de probleemoplossing te meitsjen, waard 300 mg poederige rau fêste fan Brilliant Blue FCF oplost yn 1 M NaH2PO4-bufferoplossing en skodde goed om te wurden in folslein dúdlike oplossing.De probleemoplossing waard dêrnei yn 'e flitskolom ynjeksje troch in ynjeksje.De eksperimintele opset fan 'e flitsreiniging wurdt neamd yn' e tabel 1.
| Ynstrumint | SepaBean™ masine2 | |||
| Cartridges | 12 g SepaFlash C18 RP flash cartridge (sferysk silika, 20 - 45 μm, 100 Å, Bestelnûmer: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP flash cartridge (sferysk silika, 20 - 45 μm, 100 Å, bestelnûmer: SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| Golflingte | 254 nm | |||
| Mobile faze | Oplosmiddel A: wetter Oplosmiddel B: Methanol | |||
| Flow rate | 30 ml/min | |||
| Sample laden | 300 mg (Brilliant Blue FCF mei de suverens fan 86%) | |||
| Gradient | Tiid (CV) | Oplosmiddel B (%) | Tiid (CV) | Oplosmiddel B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Resultaten en diskusje
In SepaFlash C18AQ RP flash cartridge waard brûkt foar sample desalting en suvering.Stapgradient waard brûkt wêryn suver wetter brûkt waard as de mobile faze by it begjin fan eluaasje en rûn foar 10 kolomvoluminten (CV).Lykas werjûn yn figuer 3, by it brûken fan suver wetter as de mobile faze, de stekproef waard folslein bewarre op de flash cartridge.Dêrnei waard de methanol yn 'e mobile faze direkt ferhege nei 100% en de gradient waard bewarre foar 7.5 CV.De stekproef waard út eluearre fan 11,5 nei 13,5 CV.Yn 'e sammele fraksjes waard de probleemoplossing ferfongen fan NaH2PO4-bufferoplossing nei methanol.Yn ferliking mei heul wetterige oplossing wie methanol folle makliker te ferwiderjen troch rotearjende ferdamping yn 'e folgjende stap, wat it folgjende ûndersyk fasilitearret.
figuer 3. De flash chromatogram fan de stekproef op in C18AQ cartridge.
Om it retinsjegedrach fan C18AQ-cartridge en reguliere C18-cartridge te fergelykjen foar samples fan sterke polariteit, waard parallelle fergelikingstest útfierd.In SepaFlash C18 RP flash cartridge waard brûkt en de flash chromatogram foar de stekproef waard werjûn yn figuer 4. Foar reguliere C18 cartridges, de heechste tolerearre aqueous faze ratio is likernôch 90%.Dêrom waard de startgradient ynsteld op 10% methanol yn 90% wetter.Lykas werjûn yn figuer 4, fanwege de hydrofobe faze ynstoarten fan 'e C18 keatlingen feroarsake troch hege aqueous ratio, de stekproef waard amper behâlden op de reguliere C18 cartridge en waard direkt eluted út troch de mobile faze.As gefolch kin de eksploitaasje fan sample-ûntsalting of suvering net foltôge wurde.
figuer 4. De flash chromatogram fan de stekproef op in gewoane C18 cartridge.
Yn ferliking mei lineêre gradient hat it gebrûk fan stapgradient de folgjende foardielen:
1. Solvent gebrûk en run tiid foar sample suvering wurdt fermindere.
2. It doelprodukt eluearret yn in skerpe peak, dy't it folume fan sammele fraksjes ferminderet en sadwaande de folgjende rotearjende ferdamping fasilitearret en ek tiid besparret.
3. It sammele produkt is yn methanol dy't maklik te ferdampen is, dus droege tiid wurdt fermindere.
Ta beslút, foar de suvering fan it stekproef dat is sterk polar of tige hydrophilic, SepaFlash C18AQ RP flash cartridges kombinearje mei de preparative flash chromatography systeem SepaBean ™ Machine koe biede in flugge en effisjinte oplossing.
Oer de SepaFlash Bonded Series C18 RP flash cartridges
Der binne in rige fan de SepaFlash C18AQ RP flash cartridges mei ferskillende spesifikaasjes fan Santai Technology (lykas werjûn yn Tabel 2).
| Item nûmer | Kolom Grutte | Flow Rate (ml/min) | Max. Druk (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
tabel 2. SepaFlash C18AQ RP flash cartridges.
Ferpakkingsmateriaal: Hege effisjinsje sfearysk C18(AQ)-bûn silika, 20 - 45 μm, 100 Å.
logy (lykas werjûn yn Tabel 2).
Post tiid: Aug-27-2018