Hongcheng Wang, Bo Xu
Pusat Litbang Aplikasi
Perkenalan
Menurut polaritas relatif fase diam dan fase gerak, kromatografi cair dapat dibagi menjadi kromatografi fase normal (NPC) dan kromatografi fase terbalik (RPC).Untuk RPC, polaritas fase gerak lebih kuat daripada fase diam.RPC telah menjadi yang paling banyak digunakan dalam mode pemisahan kromatografi cair karena efisiensinya yang tinggi, resolusi yang baik, dan mekanisme retensi yang jelas.Oleh karena itu RPC cocok untuk pemisahan dan pemurnian berbagai senyawa polar atau non-polar, termasuk alkaloid, karbohidrat, asam lemak, steroid, asam nukleat, asam amino, peptida, protein, dll. Dalam RPC, fase diam yang paling umum digunakan adalah matriks silika gel yang berikatan dengan berbagai gugus fungsi, termasuk C18, C8, C4, fenil, siano, amino, dll. Di antara gugus fungsi berikatan ini, yang paling banyak digunakan adalah C18.Diperkirakan lebih dari 80% RPC sekarang menggunakan fase terikat C18.Oleh karena itu kolom kromatografi C18 telah menjadi kolom universal yang wajib dimiliki setiap laboratorium.
Meskipun kolom C18 dapat digunakan dalam berbagai aplikasi yang sangat luas, namun untuk beberapa sampel yang sangat polar atau sangat hidrofilik, kolom C18 biasa mungkin mengalami masalah saat digunakan untuk memurnikan sampel tersebut.Dalam RPC, pelarut elusi yang umum digunakan dapat dipesan sesuai dengan polaritasnya: air < metanol < asetonitril < etanol < tetrahidrofuran < isopropanol.Untuk memastikan retensi yang baik pada kolom untuk sampel ini (kutub kuat atau sangat hidrofilik), proporsi sistem air yang tinggi diperlukan untuk digunakan sebagai fase gerak.Namun, ketika menggunakan sistem air murni (termasuk air murni atau larutan garam murni) sebagai fase gerak, rantai karbon panjang pada fase diam kolom C18 cenderung menghindari air dan bercampur satu sama lain, mengakibatkan penurunan seketika dalam kapasitas retensi kolom atau bahkan tanpa retensi.Fenomena ini disebut "keruntuhan fase hidrofobik" (seperti yang ditunjukkan pada bagian kiri Gambar 1).Meskipun situasi ini reversibel bila kolom dicuci dengan pelarut organik seperti metanol atau asetonitril, masih dapat menyebabkan kerusakan pada kolom.Oleh karena itu, perlu untuk mencegah situasi ini terjadi.
Gambar 1. Skema diagram fasa terikat pada permukaan silika gel pada kolom regular C18 (kiri) dan kolom C18AQ (kanan).
Untuk mengatasi masalah tersebut di atas, produsen bahan kemasan kromatografi telah melakukan perbaikan teknis.Salah satu perbaikan tersebut adalah membuat beberapa modifikasi pada permukaan matriks silika, seperti pengenalan gugus siano hidrofilik (seperti yang ditunjukkan pada bagian kanan Gambar 1), untuk membuat permukaan gel silika lebih hidrofilik.Dengan demikian rantai C18 pada permukaan silika dapat diperpanjang sepenuhnya di bawah kondisi yang sangat berair dan keruntuhan fase hidrofobik dapat dihindari.Kolom C18 yang dimodifikasi ini disebut kolom C18 berair, yaitu kolom C18AQ, yang dirancang untuk kondisi elusi yang sangat berair dan dapat mentolerir sistem berair 100%.Kolom C18AQ telah diterapkan secara luas dalam pemisahan dan pemurnian senyawa polar yang kuat, termasuk asam organik, peptida, nukleosida, dan vitamin yang larut dalam air.
Desalting adalah salah satu aplikasi khas kolom C18AQ dalam pemurnian kilat untuk sampel, yang menghilangkan komponen garam atau penyangga dalam pelarut sampel untuk memfasilitasi penerapan sampel dalam studi selanjutnya.Pada postingan ini, Brilliant Blue FCF dengan polaritas kuat digunakan sebagai sampel dan dimurnikan pada kolom C18AQ.Pelarut sampel diganti dengan pelarut organik dari larutan buffer, sehingga memfasilitasi penguapan putar berikutnya serta menghemat pelarut dan waktu pengoperasian.Selanjutnya, kemurnian sampel ditingkatkan dengan menghilangkan beberapa pengotor dalam sampel.
Bagian eksperimental
Gambar 2. Struktur kimia sampel.
Brilliant Blue FCF digunakan sebagai sampel dalam postingan ini.Kemurnian sampel mentah adalah 86% dan struktur kimia sampel ditunjukkan pada Gambar 2. Untuk menyiapkan larutan sampel, 300 mg padatan kasar bubuk Brilliant Blue FCF dilarutkan dalam larutan buffer NaH2PO4 1 M dan dikocok dengan baik hingga menjadi solusi yang benar-benar jelas.Larutan sampel kemudian diinjeksikan ke kolom flash oleh injektor.Pengaturan eksperimental pemurnian flash tercantum dalam Tabel 1.
| Instrumen | Mesin SepaBean™2 | |||
| Kartrid | Kartrid flash SepaFlash C18 RP 12 g (silika bulat, 20 - 45 μm, 100 Å, Nomor pemesanan: SW-5222-012-SP) | Kartrid flash SepaFlash C18AQ RP 12 g (silika bulat, 20 - 45 μm, 100 Å, Nomor pesanan：SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| Panjang gelombang | 254 nm | |||
| Fase gerak | Pelarut A：Air Pelarut B: Metanol | |||
| Laju aliran | 30 ml/menit | |||
| Pemuatan sampel | 300 mg (Brilliant Blue FCF dengan kemurnian 86%) | |||
| Gradien | Waktu (CV) | Pelarut B (%) | Waktu (CV) | Pelarut B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Hasil dan Diskusi
Kartrid flash SepaFlash C18AQ RP digunakan untuk desalting dan pemurnian sampel.Gradien langkah digunakan di mana air murni digunakan sebagai fase gerak pada awal elusi dan dijalankan selama 10 volume kolom (CV).Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3, saat menggunakan air murni sebagai fase gerak, sampel tertahan sepenuhnya pada kartrid flash.Selanjutnya, metanol dalam fase gerak langsung dinaikkan menjadi 100% dan gradien dipertahankan sebesar 7,5 CV.Sampel dielusi dari 11,5 hingga 13,5 CV.Pada fraksi yang terkumpul, larutan sampel diganti dari larutan penyangga NaH2PO4 menjadi metanol.Dibandingkan dengan larutan yang sangat berair, metanol jauh lebih mudah dihilangkan dengan penguapan putar pada langkah selanjutnya, yang memfasilitasi penelitian selanjutnya.
Gambar 3. Flash kromatogram sampel pada kartrid C18AQ.
Untuk membandingkan perilaku retensi kartrid C18AQ dan kartrid C18 reguler untuk sampel dengan polaritas kuat, dilakukan uji perbandingan paralel.Kartrid flash SepaFlash C18 RP digunakan dan kromatogram flash untuk sampel ditunjukkan pada Gambar 4. Untuk kartrid C18 biasa, rasio fase air tertinggi yang dapat ditoleransi adalah sekitar 90%.Oleh karena itu, gradien awal ditetapkan pada 10% metanol dalam 90% air.Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4, karena keruntuhan fase hidrofobik dari rantai C18 yang disebabkan oleh rasio air yang tinggi, sampel hampir tidak tertahan pada kartrid C18 biasa dan langsung dielusi oleh fase gerak.Akibatnya, operasi desalting atau pemurnian sampel tidak dapat diselesaikan.
Gambar 4. Flash kromatogram sampel pada kartrid C18 biasa.
Dibandingkan dengan gradien linier, penggunaan gradien langkah memiliki keuntungan sebagai berikut:
1. Penggunaan pelarut dan waktu pengoperasian untuk pemurnian sampel berkurang.
2. Produk target terelusi dalam puncak yang tajam, yang mengurangi volume fraksi yang terkumpul dan dengan demikian memfasilitasi penguapan berputar serta menghemat waktu.
3. Produk yang terkumpul berupa metanol yang mudah diuapkan, sehingga waktu pengeringan berkurang.
Sebagai kesimpulan, untuk pemurnian sampel yang sangat polar atau sangat hidrofilik, kartrid flash SepaFlash C18AQ RP yang digabungkan dengan sistem kromatografi flash preparatif Mesin SepaBean™ dapat menawarkan solusi yang cepat dan efisien.
Tentang kartrid flash SepaFlash Bonded Series C18 RP
Terdapat rangkaian flash cartridge SepaFlash C18AQ RP dengan spesifikasi berbeda dari Santai Technology (seperti terlihat pada Tabel 2).
| Nomor barang | Ukuran Kolom | Laju Aliran (mL/menit) | Tekanan Maks (psi/bilah) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 gram | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420g | 40-80 | 250/17,2 |
Tabel 2. Kartrid flash SepaFlash C18AQ RP.
Bahan pengepakan: Silika berikat C18(AQ) bulat efisiensi tinggi, 20 - 45 μm, 100 Å.
logika (seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2).
Waktu posting: 27 Agustus-2018