Хунчэн Ван, Бо Сюй
Цэнтр даследаванняў і распрацовак прымянення
Уводзіны
У адпаведнасці з адноснай палярнасцю нерухомай фазы і рухомай фазы вадкасную храматаграфію можна падзяліць на храматаграфію з нармальнай фазай (NPC) і храматаграфію з зваротнай фазай (RPC).Для RPC палярнасць рухомай фазы мацнейшая, чым нерухомай.RPC стаў найбольш шырока выкарыстоўваным у рэжымах падзелу вадкаснай храматаграфіі дзякуючы сваёй высокай эфектыўнасці, добраму раздзяленню і дакладнаму механізму ўтрымання.Такім чынам, RPC падыходзіць для падзелу і ачысткі розных палярных і непалярных злучэнняў, уключаючы алкалоіды, вугляводы, тоўстыя кіслоты, стэроіды, нуклеінавыя кіслоты, амінакіслоты, пептыды, бялкі і г. д. У RPC найбольш часта выкарыстоўваецца нерухомая фаза матрыца силикагеля, якая звязана з рознымі функцыянальнымі групамі, уключаючы C18, C8, C4, феніл, цыяна, аміна і г.д. Сярод гэтых звязаных функцыянальных груп найбольш шырока выкарыстоўваецца C18.Паводле ацэнак, больш за 80% RPC цяпер выкарыстоўваюць злучаную фазу C18.Таму храматаграфічная калонка C18 стала абавязковай універсальнай калонкай для кожнай лабараторыі.
Хаця калонка C18 можа быць выкарыстана ў вельмі шырокім дыяпазоне прымянення, тым не менш, для некаторых узораў, якія з'яўляюцца вельмі палярнымі або вельмі гідрафільнымі, звычайныя калонкі C18 могуць мець праблемы пры выкарыстанні для ачысткі такіх узораў.У RPC звычайна выкарыстоўваюцца растваральнікі для элюіравання можна ўпарадкаваць у адпаведнасці з іх палярнасцю: вада < метанол < ацэтанітрыл < этанол < тэтрагідрафуран < ізапрапанол.Для забеспячэння добрага ўтрымання на калоне для гэтых узораў (моцнапалярных або высокагідрафільных) у якасці рухомай фазы неабходна выкарыстоўваць вялікую долю воднай сістэмы.Аднак пры выкарыстанні сістэмы з чыстай вадой (уключаючы чыстую ваду або чысты раствор солі) у якасці рухомай фазы доўгі вугляродны ланцуг на нерухомай фазе калонкі C18 імкнецца пазбягаць вады і змешвацца адзін з адным, што прыводзіць да імгненнага зніжэння утрымліваючая здольнасць калоны ці нават адсутнасць утрымання.Гэта з'ява называецца «гідрафобны калапс фазы» (як паказана ў левай частцы малюнка 1).Хоць гэтая сітуацыя зварачальная, калі калонку прамываюць арганічнымі растваральнікамі, такімі як метанол або ацэтанітрыл, яна ўсё роўна можа прывесці да пашкоджання калонкі.Таму трэба не дапусціць такой сітуацыі.
Малюнак 1. Схематычная дыяграма звязаных фаз на паверхні сілікагеля ў звычайнай калонцы C18 (злева) і калонцы C18AQ (справа).
Каб вырашыць вышэйзгаданыя праблемы, вытворцы храматаграфічных упаковачных матэрыялаў унеслі тэхнічныя ўдасканаленні.Адным з гэтых удасканаленняў з'яўляецца ўнясенне некаторых мадыфікацый на паверхню матрыцы дыяксіду крэмнію, такіх як увядзенне гідрафільных цыянагруп (як паказана ў правай частцы малюнка 1), каб зрабіць паверхню геля сілікагеля больш гідрафільнай.Такім чынам, ланцугі C18 на паверхні дыяксіду крэмнія могуць быць цалкам пашыраны ва ўмовах высокай воднасці, і можна пазбегнуць калапсу гідрафобнай фазы.Гэтыя мадыфікаваныя калонкі C18 называюцца воднымі калонкамі C18, а менавіта калонкамі C18AQ, якія прызначаны для ўмоў элюіравання з высокай воднасцю і могуць пераносіць 100% водную сістэму.Калоны C18AQ шырока прымяняюцца для падзелу і ачысткі моцных палярных злучэнняў, уключаючы арганічныя кіслоты, пептыды, нуклеазіды і водарастваральныя вітаміны.
Абяссольванне з'яўляецца адным з тыповых прымянення калонак C18AQ пры імгненнай ачыстцы ўзораў, якое выдаляе соль або буферныя кампаненты ў растваральніку ўзору для палягчэння прымянення ўзору ў наступных даследаваннях.У гэтай публікацыі ў якасці ўзору быў выкарыстаны Brilliant Blue FCF з моцнай палярнасцю і ачышчаны на калонцы C18AQ.Узор растваральніка быў заменены арганічным растваральнікам з буфернага раствора, што палягчае наступнае ротарнае выпарванне, а таксама эканомію растваральнікаў і час працы.Акрамя таго, чысціня ўзору была палепшана шляхам выдалення некаторых прымешак ва ўзоры.
Эксперыментальны аддзел
Малюнак 2. Хімічная структура ўзору.
Brilliant Blue FCF быў выкарыстаны ў якасці ўзору ў гэтай публікацыі.Чысціня неапрацаванага ўзору складала 86%, а хімічная структура ўзору была паказана на малюнку 2. Для падрыхтоўкі раствора ўзору 300 мг парашкападобнага сырога цвёрдага рэчыва Brilliant Blue FCF растваралі ў 1 М буферным растворы NaH2PO4 і добра боўталі, каб стаць цалкам зразумелае рашэнне.Раствор пробы затым быў уведзены ў флэш-калонку з дапамогай інжэктара.Эксперыментальная ўстаноўка флэш-ачысткі прыведзена ў табліцы 1.
| інструмент | Машына SepaBean™2 | |||
| Патроны | 12 г флэш-картрыдж SepaFlash C18 RP (сферычны дыяксід крэмнія, 20 - 45 мкм, 100 Å, нумар замовы: SW-5222-012-SP) | 12 г SepaFlash C18AQ RP флэш-картрыдж (сферычны дыяксід крэмнія, 20 - 45 мкм, 100 Å, нумар для замовы: SW-5222-012-SP(AQ))) | ||
| Даўжыня хвалі | 254 нм | |||
| Мабільная фаза | Растваральнік А: вада Растваральнік B: метанол | |||
| Хуткасць патоку | 30 мл/хв | |||
| Загрузка ўзору | 300 мг (Brilliant Blue FCF з чысцінёй 86%) | |||
| Градыент | Час (CV) | Растваральнік B (%) | Час (CV) | Растваральнік B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Вынікі і абмеркаванне
Для абяссолвання і ачысткі ўзору выкарыстоўваўся флэш-картрыдж SepaFlash C18AQ RP.Выкарыстоўваўся ступенчаты градыент, у якім у якасці рухомай фазы ў пачатку элюіравання выкарыстоўвалася чыстая вада і праходзіў 10 аб'ёмаў калонкі (CV).Як паказана на малюнку 3, пры выкарыстанні чыстай вады ў якасці рухомай фазы ўзор цалкам заставаўся на флэш-картрыджы.Затым метанол у рухомай фазе непасрэдна павялічвалі да 100%, а градыент падтрымлівалі на працягу 7,5 CV.Узор быў элюіраваны ад 11,5 да 13,5 CV.У сабраных фракцыях раствор пробы быў заменены з буфернага раствора NaH2PO4 на метанол.У параўнанні з высокаводным растворам, метанол было значна лягчэй выдаліць з дапамогай ротарнага выпарвання на наступным этапе, што палягчае наступныя даследаванні.
Малюнак 3. Флэш-хроматаграма ўзору на картрыджы C18AQ.
Каб параўнаць характарыстыкі ўтрымання картрыджа C18AQ і звычайнага картрыджа C18 для ўзораў з моцнай палярнасцю, быў праведзены тэст паралельнага параўнання.Выкарыстоўваўся флэш-картрыдж SepaFlash C18 RP, а флэш-храматаграма для ўзору была паказана на малюнку 4. Для звычайных картрыджаў C18 самае высокае дапушчальнае суадносіны воднай фазы складае каля 90%.Таму стартавы градыент быў усталяваны на 10% метанолу ў 90% вады.Як паказана на малюнку 4, з-за калапсу гідрафобнай фазы ланцугоў C18, выкліканага высокім водным суадносінамі, узор амаль не затрымліваўся на звычайным картрыджы C18 і непасрэдна вымываўся рухомай фазай.У выніку аперацыя абяссолвання або ачысткі проб не можа быць завершана.
Малюнак 4. Флэш-хроматаграма ўзору на звычайным картрыджы C18.
У параўнанні з лінейным градыентам выкарыстанне ступеністага градыенту мае наступныя перавагі:
1. Скарачаецца выкарыстанне растваральніка і час працы для ачысткі ўзору.
2. Мэтавы прадукт элюіруецца з рэзкім пікам, што памяншае аб'ём сабраных фракцый і, такім чынам, палягчае наступнае ротарнае выпарванне, а таксама эканоміць час.
3. Сабраны прадукт знаходзіцца ў метаноле, які лёгка выпараецца, такім чынам час сушкі скарачаецца.
У заключэнне, для ачысткі ўзору, які з'яўляецца моцна палярным або вельмі гідрафільным, флэш-картрыджы SepaFlash C18AQ RP у спалучэнні з сістэмай прэпаратыўнай флэш-храматаграфіі SepaBean™ Machine могуць прапанаваць хуткае і эфектыўнае рашэнне.
Аб флэш-картрыджах SepaFlash Bonded Series C18 RP
Ёсць серыя флэш-картрыджаў SepaFlash C18AQ RP з рознымі характарыстыкамі ад Santai Technology (як паказана ў табліцы 2).
| Нумар прадмета | Памер слупка | Хуткасць патоку (мл/мін) | Макс.ціск (псі/бар) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 г | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 г | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 г | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 г | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 г | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 г | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 г | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 г | 40-80 | 250/17,2 |
Табліца 2. Флэш-картрыджы SepaFlash C18AQ RP.
Упаковачныя матэрыялы: высокаэфектыўны сферычны дыяксід крэмнія C18(AQ), 20 - 45 мкм, 100 Å.
логіі (як паказана ў табліцы 2).
Час размяшчэння: 27 жніўня 2018 г