Hongcheng Wang, Bo Xu
Centro di ricerca e sviluppo applicativo
introduzione
Secondo le polarità relative della fase stazionaria e della fase mobile, la cromatografia liquida può essere suddivisa in cromatografia in fase normale (NPC) e cromatografia in fase inversa (RPC).Per RPC, la polarità della fase mobile è più forte di quella della fase stazionaria.RPC è diventato il più utilizzato nelle modalità di separazione della cromatografia liquida grazie alla sua elevata efficienza, buona risoluzione e chiaro meccanismo di ritenzione.Pertanto RPC è adatto per la separazione e la purificazione di vari composti polari o non polari, inclusi alcaloidi, carboidrati, acidi grassi, steroidi, acidi nucleici, amminoacidi, peptidi, proteine, ecc. In RPC, la fase stazionaria più comunemente usata è la matrice di gel di silice che è legata a vari gruppi funzionali, tra cui C18, C8, C4, fenile, ciano, ammino, ecc. Tra questi gruppi funzionali legati, il più utilizzato è C18.Si stima che oltre l'80% di RPC utilizzi ora la fase legata C18.Pertanto la colonna cromatografica C18 è diventata una colonna universale indispensabile per ogni laboratorio.
Sebbene la colonna C18 possa essere utilizzata in una gamma molto ampia di applicazioni, tuttavia, per alcuni campioni molto polari o altamente idrofili, le normali colonne C18 possono avere problemi quando vengono utilizzate per purificare tali campioni.In RPC, i solventi di eluizione comunemente usati possono essere ordinati in base alla loro polarità: acqua < metanolo < acetonitrile < etanolo < tetraidrofurano < isopropanolo.Per garantire una buona ritenzione sulla colonna per questi campioni (fortemente polari o altamente idrofili), è necessario utilizzare un'elevata percentuale di sistema acquoso come fase mobile.Tuttavia, quando si utilizza un sistema di acqua pura (inclusa acqua pura o soluzione salina pura) come fase mobile, la lunga catena di carbonio sulla fase stazionaria della colonna C18 tende a evitare l'acqua e a mescolarsi l'una con l'altra, determinando una diminuzione istantanea della capacità di ritenzione della colonna o addirittura nessuna ritenzione.Questo fenomeno è chiamato "collasso di fase idrofobica" (come mostrato nella parte sinistra della Figura 1).Sebbene questa situazione sia reversibile quando la colonna viene lavata con solventi organici come metanolo o acetonitrile, può comunque causare danni alla colonna.Pertanto, è necessario evitare che questa situazione si verifichi.
Figura 1. Il diagramma schematico delle fasi legate sulla superficie del gel di silice nella normale colonna C18 (a sinistra) e nella colonna C18AQ (a destra).
Per affrontare i problemi sopra menzionati, i produttori di materiali di imballaggio cromatografici hanno apportato miglioramenti tecnici.Uno di questi miglioramenti consiste nell'apportare alcune modifiche sulla superficie della matrice di silice, come l'introduzione di gruppi ciano idrofili (come mostrato nella parte destra della Figura 1), per rendere la superficie del gel di silice più idrofila.Così le catene C18 sulla superficie della silice potrebbero essere completamente estese in condizioni altamente acquose e potrebbe essere evitato il collasso della fase idrofobica.Queste colonne C18 modificate sono chiamate colonne C18 acquose, vale a dire colonne C18AQ, che sono progettate per condizioni di eluizione altamente acquose e possono tollerare un sistema acquoso al 100%.Le colonne C18AQ sono state ampiamente utilizzate nella separazione e purificazione di composti polari forti, inclusi acidi organici, peptidi, nucleosidi e vitamine idrosolubili.
La dissalazione è una delle applicazioni tipiche delle colonne C18AQ nella purificazione flash per campioni, che rimuove i componenti salini o tampone nel solvente del campione per facilitare l'applicazione del campione negli studi successivi.In questo post, il Brilliant Blue FCF con forte polarità è stato utilizzato come campione e purificato sulla colonna C18AQ.Il solvente del campione è stato sostituito dal solvente organico della soluzione tampone, facilitando così la successiva evaporazione rotante e risparmiando solventi e tempo operativo.Inoltre, la purezza del campione è stata migliorata rimuovendo alcune impurità nel campione.
sezione sperimentale
Figura 2. La struttura chimica del campione.
Il Brilliant Blue FCF è stato utilizzato come campione in questo post.La purezza del campione grezzo era dell'86% e la struttura chimica del campione è stata mostrata nella Figura 2. Per preparare la soluzione del campione, 300 mg di solido grezzo in polvere di Brilliant Blue FCF sono stati sciolti in una soluzione tampone NaH2PO4 1 M e agitati bene per diventare una soluzione completamente chiara.La soluzione campione è stata quindi iniettata nella colonna flash mediante un iniettore.La configurazione sperimentale della purificazione flash è elencata nella Tabella 1.
| Strumento | Macchina SepaBean™2 | |||
| Cartucce | Cartuccia flash SepaFlash C18 RP da 12 g (silice sferica, 20 - 45 μm, 100 Å, numero d'ordine: SW-5222-012-SP) | Cartuccia flash SepaFlash C18AQ RP da 12 g (silice sferica, 20 - 45 μm, 100 Å, numero d'ordine：SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| Lunghezza d'onda | 254nm | |||
| Fase mobile | Solvente A：Acqua Solvente B：Metanolo | |||
| Portata | 30ml/min | |||
| Caricamento del campione | 300 mg (Brilliant Blue FCF con purezza dell'86%) | |||
| Pendenza | Tempo (CV) | Solvente B (%) | Tempo (CV) | Solvente B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Risultati e discussione
Per la desalinizzazione e la purificazione del campione è stata utilizzata una cartuccia flash SepaFlash C18AQ RP.È stato utilizzato il gradiente a gradini in cui è stata utilizzata acqua pura come fase mobile all'inizio dell'eluizione e fatta scorrere per 10 volumi di colonna (CV).Come mostrato nella Figura 3, quando si utilizza acqua pura come fase mobile, il campione è stato completamente trattenuto sulla cartuccia flash.Successivamente, il metanolo nella fase mobile è stato aumentato direttamente al 100% e il gradiente è stato mantenuto per 7,5 CV.Il campione è stato eluito da 11,5 a 13,5 CV.Nelle frazioni raccolte, la soluzione campione è stata sostituita dalla soluzione tampone NaH2PO4 a metanolo.Rispetto alla soluzione altamente acquosa, il metanolo era molto più facile da rimuovere mediante evaporazione rotante nella fase successiva, il che facilita la ricerca successiva.
Figura 3. Il cromatogramma flash del campione su una cartuccia C18AQ.
Per confrontare il comportamento di ritenzione della cartuccia C18AQ e della normale cartuccia C18 per campioni di forte polarità, è stato eseguito un test di confronto parallelo.È stata utilizzata una cartuccia flash SepaFlash C18 RP e il cromatogramma flash per il campione è stato mostrato nella Figura 4. Per le normali cartucce C18, il più alto rapporto di fase acquosa tollerato è di circa il 90%.Pertanto il gradiente iniziale è stato fissato al 10% di metanolo nel 90% di acqua.Come mostrato nella Figura 4, a causa del collasso della fase idrofobica delle catene C18 causato dall'elevato rapporto acquoso, il campione è stato trattenuto a malapena sulla normale cartuccia C18 ed è stato eluito direttamente dalla fase mobile.Di conseguenza, l'operazione di desalinizzazione o purificazione del campione non può essere completata.
Figura 4. Il cromatogramma flash del campione su una normale cartuccia C18.
Rispetto al gradiente lineare, l'uso del gradiente graduale presenta i seguenti vantaggi:
1. L'utilizzo del solvente e il tempo di esecuzione per la purificazione del campione sono ridotti.
2. Il prodotto target eluisce in un picco netto, che riduce il volume delle frazioni raccolte e quindi facilita la successiva evaporazione rotativa oltre a risparmiare tempo.
3. Il prodotto raccolto è in metanolo che è facile da evaporare, quindi il tempo di asciugatura è ridotto.
In conclusione, per la purificazione del campione fortemente polare o altamente idrofilo, le cartucce flash SepaFlash C18AQ RP combinate con il sistema di cromatografia flash preparativa SepaBean™ Machine potrebbero offrire una soluzione rapida ed efficiente.
Informazioni sulle cartucce flash SepaFlash Bonded Series C18 RP
Esiste una serie di cartucce flash SepaFlash C18AQ RP con specifiche diverse da Santai Technology (come mostrato nella Tabella 2).
| Codice articolo | Dimensione colonna | Portata (ml/minuto) | Max.Pressione (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 gr | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 gr | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 gr | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 gr | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 gr | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 gr | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 grammi | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420gr | 40-80 | 250/17.2 |
Tabella 2. Cartucce flash SepaFlash C18AQ RP.
Materiali di riempimento: silice sferica ad alta efficienza legata con C18(AQ), 20 - 45 μm, 100 Å.
logia (come mostrato nella Tabella 2).
Tempo di pubblicazione: 27 agosto-2018