Hongcheng Wang, Bo Xu
Sovelluksen T&K-keskus
Johdanto
Stationaarifaasin ja liikkuvan faasin suhteellisten polariteettien mukaan nestekromatografia voidaan jakaa normaalifaasikromatografiaan (NPC) ja käänteisfaasikromatografiaan (RPC).RPC:ssä liikkuvan vaiheen polariteetti on vahvempi kuin kiinteän vaiheen.RPC:stä on tullut laajimmin käytetty nestekromatografian erotusmuodoissa sen korkean tehokkuuden, hyvän resoluution ja selkeän retentiomekanismin ansiosta.Siksi RPC soveltuu erilaisten polaaristen tai ei-polaaristen yhdisteiden, mukaan lukien alkaloidit, hiilihydraatit, rasvahapot, steroidit, nukleiinihapot, aminohapot, peptidit, proteiinit jne. erottamiseen ja puhdistamiseen. RPC:ssä yleisimmin käytetty stationaarifaasi on silikageelimatriisi, joka on sitoutunut erilaisiin funktionaalisiin ryhmiin, mukaan lukien C18, C8, C4, fenyyli, syaani, amino jne. Näistä sitoutuneista funktionaalisista ryhmistä laajimmin käytetty on C18.On arvioitu, että yli 80 % RPC:stä käyttää nyt C18-sidosfaasia.Siksi C18-kromatografiakolonnista on tullut pakollinen universaali kolonni jokaisessa laboratoriossa.
Vaikka C18-kolonnia voidaan käyttää hyvin monenlaisissa sovelluksissa, tavallisissa C18-kolonneissa voi kuitenkin esiintyä ongelmia joidenkin näytteiden osalta, jotka ovat erittäin polaarisia tai erittäin hydrofiilisiä, kun niitä käytetään tällaisten näytteiden puhdistamiseen.RPC:ssä yleisesti käytetyt eluointiliuottimet voidaan järjestää niiden polaarisuuden mukaan: vesi < metanoli < asetonitriili < etanoli < tetrahydrofuraani < isopropanoli.Näiden näytteiden (vahvasti polaarinen tai erittäin hydrofiilinen) hyvän retention varmistamiseksi pylväässä on välttämätöntä käyttää suurta vesipitoista järjestelmää liikkuvana faasina.Kuitenkin käytettäessä puhdasvesijärjestelmää (mukaan lukien puhdas vesi tai puhdas suolaliuos) liikkuvana faasina, C18-kolonnin kiinteässä faasissa oleva pitkä hiiliketju pyrkii välttämään vettä ja sekoittumaan keskenään, mikä johtaa välittömään laskuun kolonnin retentiokykyä tai jopa olematonta.Tätä ilmiötä kutsutaan "hydrofobisen vaiheen romahdukseksi" (kuten kuvan 1 vasemmasta osasta näkyy).Vaikka tämä tilanne on palautuva, kun kolonni pestään orgaanisilla liuottimilla, kuten metanolilla tai asetonitriilillä, se voi silti vahingoittaa kolonnia.Siksi on välttämätöntä estää tämän tilanteen syntyminen.
Kuva 1. Kaavakuva sitoutuneista faaseista silikageelin pinnalla tavallisessa C18-kolonnissa (vasemmalla) ja C18AQ-kolonnissa (oikealla).
Yllä mainittujen ongelmien ratkaisemiseksi kromatografisten pakkausmateriaalien valmistajat ovat tehneet teknisiä parannuksia.Yksi näistä parannuksista on joidenkin muutosten tekeminen piidioksidimatriisin pintaan, kuten hydrofiilisten syanoryhmien lisääminen (kuten on esitetty kuvan 1 oikealla puolella), jotta silikageelin pinta olisi hydrofiilisempi.Siten piidioksidin pinnalla olevat C18-ketjut voitiin pidentää täysin erittäin vesipitoisissa olosuhteissa ja hydrofobisen faasin romahtaminen voitiin välttää.Näitä modifioituja C18-kolonneja kutsutaan vesipitoisiksi C18-kolonneiksi, nimittäin C18AQ-kolonneiksi, jotka on suunniteltu erittäin vesipitoisiin eluointiolosuhteisiin ja jotka kestävät 100-prosenttista vesipitoista järjestelmää.C18AQ-kolonneja on käytetty laajalti vahvojen polaaristen yhdisteiden, mukaan lukien orgaanisten happojen, peptidien, nukleosidien ja vesiliukoisten vitamiinien, erottamisessa ja puhdistuksessa.
Suolanpoisto on yksi C18AQ-kolonnien tyypillisistä sovelluksista näytteiden flash-puhdistuksessa, joka poistaa suola- tai puskurikomponentit näytteen liuottimesta helpottaakseen näytteen käyttöä myöhemmissä tutkimuksissa.Tässä viestissä näytteenä käytettiin vahvan polaarisuuden omaavaa Brilliant Blue FCF:ää, joka puhdistettiin C18AQ-kolonnissa.Näytteen liuotin korvattiin orgaanisella liuottimella puskuriliuoksesta, mikä helpotti seuraavaa pyöröhaihdutusta sekä säästää liuottimia ja käyttöaikaa.Lisäksi näytteen puhtautta parannettiin poistamalla joitain epäpuhtauksia näytteestä.
Kokeellinen osa
Kuva 2. Näytteen kemiallinen rakenne.
Tässä viestissä näytteenä käytettiin Brilliant Blue FCF:ää.Raakanäytteen puhtaus oli 86 % ja näytteen kemiallinen rakenne on esitetty kuvassa 2. Näyteliuoksen valmistamiseksi 300 mg Brilliant Blue FCF:n jauhemaista raakaa kiinteää ainetta liuotettiin 1 M NaH2PO4-puskuriliuokseen ja ravisteltiin hyvin. täysin selkeä ratkaisu.Näyteliuos injektoitiin sitten flash-kolonniin injektorilla.Flash-puhdistuksen kokeellinen asetus on lueteltu taulukossa 1.
| Instrumentti | SepaBean™ kone2 | |||
| Kasetit | 12 g SepaFlash C18 RP -salamapatruuna (pallomainen piidioksidi, 20 - 45 μm, 100 Å, tilausnumero: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP -salamapatruuna (pallomainen piidioksidi, 20 - 45 μm, 100 Å, tilausnumero: SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| Aallonpituus | 254 nm | |||
| Liikkuva vaihe | Liuotin A: Vesi Liuotin B: Metanoli | |||
| Virtausnopeus | 30 ml/min | |||
| Näytteen lataus | 300 mg (Brilliant Blue FCF, jonka puhtaus on 86 %) | |||
| Kaltevuus | Aika (CV) | Liuotin B (%) | Aika (CV) | Liuotin B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Tulokset ja keskustelu
Näytteen suolanpoistoon ja puhdistukseen käytettiin SepaFlash C18AQ RP -flash-patruunaa.Käytettiin vaihegradienttia, jossa puhdasta vettä käytettiin liikkuvana faasina eluoinnin alussa ja ajettiin 10 kolonnitilavuudella (CV).Kuten kuvasta 3 käy ilmi, kun puhdasta vettä käytettiin liikkuvana faasina, näyte pysyi täysin flash-patruunassa.Seuraavaksi metanoli liikkuvassa faasissa nostettiin suoraan 100 %:iin ja gradienttia ylläpidettiin 7,5 CV:n ajan.Näyte eluoitui 11,5 - 13,5 CV:stä.Kerätyissä fraktioissa näyteliuos korvattiin NaH2PO4-puskuriliuoksesta metanoliin.Verrattuna voimakkaasti vesipitoiseen liuokseen, metanoli oli paljon helpompi poistaa pyöröhaihdutuksella seuraavassa vaiheessa, mikä helpottaa seuraavaa tutkimusta.
Kuva 3. C18AQ-patruunan näytteen flash-kromatogrammi.
C18AQ-patruunan ja tavallisen C18-patruunan retentiokäyttäytymisen vertaamiseksi vahvan napaisuuden omaaville näytteille suoritettiin rinnakkaisvertailutesti.Käytettiin SepaFlash C18 RP -flash-patruunaa ja näytteen flash-kromatogrammi on esitetty kuvassa 4. Tavallisilla C18-patruunoilla suurin siedetty vesifaasisuhde on noin 90 %.Siksi aloitusgradientti asetettiin arvoon 10 % metanolia 90 % vedessä.Kuten kuviossa 4 esitetään, suuren vesisuhteen aiheuttaman C18-ketjujen hydrofobisen faasin romahtamisen vuoksi näyte pysyi tuskin tavallisessa C18-patruunassa ja eluoitui suoraan ulos liikkuvasta faasista.Tämän seurauksena näytteen suolanpoistoa tai puhdistusta ei voida saattaa loppuun.
Kuva 4. Tavallisen C18-patruunan näytteen flash-kromatogrammi.
Lineaariseen gradienttiin verrattuna askelgradientin käytöllä on seuraavat edut:
1. Liuottimen käyttö ja ajoaika näytteen puhdistukseen vähenevät.
2. Kohdetuote eluoituu terävänä piikinä, mikä vähentää kerättyjen fraktioiden tilavuutta ja siten helpottaa seuraavaa pyöröhaihdutusta sekä säästää aikaa.
3. Kerätty tuote on metanolissa, joka on helppo haihduttaa, jolloin kuivausaika lyhenee.
Yhteenvetona voidaan todeta, että voimakkaasti polaarisen tai erittäin hydrofiilisen näytteen puhdistamiseen SepaFlash C18AQ RP -flash-patruunat, jotka yhdistetään preparatiiviseen flash-kromatografiajärjestelmään SepaBean™ Machine, voivat tarjota nopean ja tehokkaan ratkaisun.
Tietoja SepaFlash Bonded Series C18 RP -salamapatruunoista
Santai Technologylta on saatavilla useita SepaFlash C18AQ RP -salamakasetteja, joilla on erilaiset tekniset tiedot (ks. taulukko 2).
| Tuotenumero | Sarakkeen koko | Virtausnopeus (ml/min) | Max.paine (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17,2 |
Taulukko 2. SepaFlash C18AQ RP -salamakasetit.
Pakkausmateriaalit: Tehokas pallomainen C18(AQ)-sidottu piidioksidi, 20 - 45 μm, 100 Å.
(kuten taulukosta 2 näkyy).
Postitusaika: 27.8.2018