Hongcheng Wang, Bo Xu
Centre de R&D applicative
Introduction
Selon les polarités relatives de la phase stationnaire et de la phase mobile, la chromatographie liquide peut être divisée en chromatographie en phase normale (NPC) et chromatographie en phase inversée (RPC).Pour RPC, la polarité de la phase mobile est plus forte que celle de la phase stationnaire.Le RPC est devenu le plus largement utilisé dans les modes de séparation par chromatographie liquide en raison de sa grande efficacité, de sa bonne résolution et de son mécanisme de rétention clair.Par conséquent, le RPC convient à la séparation et à la purification de divers composés polaires ou non polaires, notamment les alcaloïdes, les glucides, les acides gras, les stéroïdes, les acides nucléiques, les acides aminés, les peptides, les protéines, etc. Dans le RPC, la phase stationnaire la plus couramment utilisée est la matrice de gel de silice qui est liée à divers groupes fonctionnels, notamment C18, C8, C4, phényle, cyano, amino, etc. Parmi ces groupes fonctionnels liés, le plus utilisé est C18.On estime que plus de 80 % des RPC utilisent désormais la phase greffée C18.Par conséquent, la colonne de chromatographie C18 est devenue une colonne universelle incontournable pour chaque laboratoire.
Bien que la colonne C18 puisse être utilisée dans une très large gamme d'applications, cependant, pour certains échantillons très polaires ou hautement hydrophiles, les colonnes C18 ordinaires peuvent poser des problèmes lorsqu'elles sont utilisées pour purifier de tels échantillons.Dans RPC, les solvants d'élution couramment utilisés peuvent être classés en fonction de leur polarité : eau < méthanol < acétonitrile < éthanol < tétrahydrofuranne < isopropanol.Pour assurer une bonne rétention sur la colonne pour ces échantillons (fortement polaires ou hautement hydrophiles), une proportion élevée de système aqueux est nécessaire pour être utilisée comme phase mobile.Cependant, lors de l'utilisation d'un système d'eau pure (y compris de l'eau pure ou une solution saline pure) comme phase mobile, la longue chaîne carbonée sur la phase stationnaire de la colonne C18 a tendance à éviter l'eau et à se mélanger, entraînant une diminution instantanée de la capacité de rétention de la colonne voire pas de rétention.Ce phénomène est appelé « effondrement de phase hydrophobe » (comme le montre la partie gauche de la figure 1).Bien que cette situation soit réversible lorsque la colonne est lavée avec des solvants organiques tels que le méthanol ou l'acétonitrile, elle peut toujours endommager la colonne.Par conséquent, il est nécessaire d'empêcher que cette situation ne se produise.
Figure 1. Le diagramme schématique des phases liées à la surface du gel de silice dans la colonne C18 régulière (à gauche) et la colonne C18AQ (à droite).
Pour résoudre les problèmes mentionnés ci-dessus, les fabricants de matériaux de garnissage chromatographique ont apporté des améliorations techniques.L'une de ces améliorations consiste à apporter certaines modifications à la surface de la matrice de silice, telles que l'introduction de groupes cyano hydrophiles (comme indiqué dans la partie droite de la figure 1), pour rendre la surface du gel de silice plus hydrophile.Ainsi, les chaînes C18 à la surface de la silice pourraient être complètement étendues dans des conditions hautement aqueuses et l'effondrement de la phase hydrophobe pourrait être évité.Ces colonnes C18 modifiées sont appelées colonnes C18 aqueuses, à savoir les colonnes C18AQ, qui sont conçues pour des conditions d'élution fortement aqueuses et peuvent tolérer un système aqueux à 100 %.Les colonnes C18AQ ont été largement utilisées dans la séparation et la purification de composés polaires forts, notamment les acides organiques, les peptides, les nucléosides et les vitamines hydrosolubles.
Le dessalage est l'une des applications typiques des colonnes C18AQ dans la purification flash des échantillons, qui élimine le sel ou les composants tampons dans le solvant de l'échantillon pour faciliter l'application de l'échantillon dans les études ultérieures.Dans ce post, le Brilliant Blue FCF à forte polarité a été utilisé comme échantillon et purifié sur la colonne C18AQ.Le solvant de l'échantillon a été remplacé par un solvant organique de la solution tampon, facilitant ainsi l'évaporation rotative suivante ainsi qu'une économie de solvants et de temps de fonctionnement.De plus, la pureté de l'échantillon a été améliorée en éliminant certaines impuretés dans l'échantillon.
Section expérimentale
Figure 2. La structure chimique de l'échantillon.
Le Brilliant Blue FCF a été utilisé comme échantillon dans cet article.La pureté de l'échantillon brut était de 86 % et la structure chimique de l'échantillon était illustrée à la figure 2. Pour préparer la solution d'échantillon, 300 mg de solide brut pulvérulent de bleu brillant FCF ont été dissous dans une solution tampon de NaH2PO4 1 M et bien agités pour devenir une solution tout à fait claire.La solution d'échantillon a ensuite été injectée dans la colonne flash par un injecteur.La configuration expérimentale de la purification flash est répertoriée dans le tableau 1.
| Instrument | Machine SepaBean™2 | |||
| Cartouches | Cartouche flash SepaFlash C18 RP 12 g (silice sphérique, 20 - 45 μm, 100 Å, référence : SW-5222-012-SP) | Cartouche flash SepaFlash C18AQ RP 12 g (silice sphérique, 20 - 45 μm, 100 Å, Numéro de commande : SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| Longueur d'onde | 254 nm | |||
| Phase mobile | Solvant A：Eau Solvant B：Méthanol | |||
| Débit | 30 mL/min | |||
| Chargement de l'échantillon | 300 mg (Brilliant Blue FCF avec une pureté de 86%) | |||
| Pente | Temps (CV) | Solvant B (%) | Temps (CV) | Solvant B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Résultats et discussion
Une cartouche flash SepaFlash C18AQ RP a été utilisée pour le dessalage et la purification des échantillons.Un gradient par étapes a été utilisé dans lequel de l'eau pure a été utilisée comme phase mobile au début de l'élution et a fonctionné pendant 10 volumes de colonne (CV).Comme le montre la figure 3, lors de l'utilisation d'eau pure comme phase mobile, l'échantillon a été complètement retenu sur la cartouche flash.Ensuite, le méthanol dans la phase mobile a été directement porté à 100 % et le gradient a été maintenu pendant 7,5 CV.L'échantillon a été élué de 11,5 à 13,5 CV.Dans les fractions collectées, la solution d'échantillon a été remplacée de la solution tampon de NaH2PO4 au méthanol.Comparé à une solution hautement aqueuse, le méthanol était beaucoup plus facile à éliminer par évaporation rotative dans l'étape suivante, ce qui facilite les recherches suivantes.
Figure 3. Le chromatogramme flash de l'échantillon sur une cartouche C18AQ.
Pour comparer le comportement de rétention de la cartouche C18AQ et de la cartouche C18 ordinaire pour des échantillons de forte polarité, un test de comparaison parallèle a été effectué.Une cartouche flash SepaFlash C18 RP a été utilisée et le chromatogramme flash de l'échantillon a été illustré à la figure 4. Pour les cartouches C18 ordinaires, le rapport de phase aqueuse toléré le plus élevé est d'environ 90 %.Par conséquent, le gradient de départ a été fixé à 10 % de méthanol dans 90 % d'eau.Comme le montre la figure 4, en raison de l'effondrement de la phase hydrophobe des chaînes C18 causée par un rapport aqueux élevé, l'échantillon a été à peine retenu sur la cartouche C18 régulière et a été directement élué par la phase mobile.En conséquence, l'opération de dessalage ou de purification de l'échantillon ne peut pas être achevée.
Figure 4. Le chromatogramme flash de l'échantillon sur une cartouche C18 ordinaire.
Par rapport au gradient linéaire, l'utilisation du gradient par étapes présente les avantages suivants :
1. L'utilisation de solvant et le temps d'exécution pour la purification de l'échantillon sont réduits.
2. Le produit cible s'élue en un pic net, ce qui réduit le volume des fractions collectées et facilite ainsi l'évaporation rotative suivante ainsi que le gain de temps.
3. Le produit collecté est dans du méthanol facile à évaporer, ce qui réduit le temps de séchage.
En conclusion, pour la purification de l'échantillon fortement polaire ou fortement hydrophile, les cartouches flash SepaFlash C18AQ RP associées au système de chromatographie flash préparative SepaBean™ Machine pourraient offrir une solution rapide et efficace.
À propos des cartouches flash SepaFlash Bonded Series C18 RP
Il existe une série de cartouches flash SepaFlash C18AQ RP avec des spécifications différentes de Santai Technology (comme indiqué dans le tableau 2).
| Numéro d'article | Taille de la colonne | Débit (mL/minute) | Max.Pression (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 grammes | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 grammes | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420g | 40-80 | 250/17.2 |
Tableau 2. Cartouches flash SepaFlash C18AQ RP.
Matériaux de garnissage : Silice sphérique à liaison C18(AQ) à haut rendement, 20 - 45 μm, 100 Å.
logie (comme le montre le tableau 2).
Heure de publication : 27 août 2018