होंगचेंग वांग, बो जू
अनुप्रयोग अनुसंधान एवं विकास केंद्र
परिचय
स्थिर चरण और मोबाइल चरण की सापेक्ष ध्रुवता के अनुसार, तरल क्रोमैटोग्राफी को सामान्य चरण क्रोमैटोग्राफी (एनपीसी) और उलट चरण क्रोमैटोग्राफी (आरपीसी) में विभाजित किया जा सकता है।आरपीसी के लिए, मोबाइल चरण की ध्रुवीयता स्थिर चरण की तुलना में अधिक मजबूत होती है।आरपीसी अपनी उच्च दक्षता, अच्छे रिज़ॉल्यूशन और स्पष्ट अवधारण तंत्र के कारण तरल क्रोमैटोग्राफी पृथक्करण मोड में सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला एक बन गया है।इसलिए आरपीसी एल्कलॉइड, कार्बोहाइड्रेट, फैटी एसिड, स्टेरॉयड, न्यूक्लिक एसिड, अमीनो एसिड, पेप्टाइड्स, प्रोटीन आदि सहित विभिन्न ध्रुवीय या गैर-ध्रुवीय यौगिकों के पृथक्करण और शुद्धिकरण के लिए उपयुक्त है। आरपीसी में, सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला स्थिर चरण है सिलिका जेल मैट्रिक्स जो विभिन्न कार्यात्मक समूहों के साथ जुड़ा हुआ है, जिसमें C18, C8, C4, फिनाइल, सायनो, अमीनो आदि शामिल हैं। इन बंधे हुए कार्यात्मक समूहों में, सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला C18 है।यह अनुमान लगाया गया है कि 80% से अधिक RPC अब C18 बंधित चरण का उपयोग कर रहे हैं।इसलिए C18 क्रोमैटोग्राफी कॉलम प्रत्येक प्रयोगशाला के लिए एक आवश्यक सार्वभौमिक कॉलम बन गया है।
हालाँकि C18 कॉलम का उपयोग अनुप्रयोगों की एक बहुत विस्तृत श्रृंखला में किया जा सकता है, हालाँकि, कुछ नमूनों के लिए जो बहुत ध्रुवीय या अत्यधिक हाइड्रोफिलिक हैं, ऐसे नमूनों को शुद्ध करने के लिए नियमित C18 कॉलम का उपयोग करने पर समस्याएँ हो सकती हैं।आरपीसी में, आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले एल्यूशन सॉल्वैंट्स को उनकी ध्रुवता के अनुसार ऑर्डर किया जा सकता है: पानी < मेथनॉल < एसीटोनिट्राइल < इथेनॉल < टेट्राहाइड्रोफ्यूरान < आइसोप्रोपेनॉल।इन नमूनों (मजबूत ध्रुवीय या अत्यधिक हाइड्रोफिलिक) के लिए कॉलम पर अच्छी अवधारण सुनिश्चित करने के लिए, जलीय प्रणाली के उच्च अनुपात को मोबाइल चरण के रूप में उपयोग करना आवश्यक है।हालाँकि, मोबाइल चरण के रूप में शुद्ध जल प्रणाली (शुद्ध पानी या शुद्ध नमक समाधान सहित) का उपयोग करते समय, C18 कॉलम के स्थिर चरण पर लंबी कार्बन श्रृंखला पानी से बचती है और एक दूसरे के साथ मिश्रित होती है, जिसके परिणामस्वरूप तात्कालिक कमी आती है। स्तंभ की प्रतिधारण क्षमता या यहां तक कि कोई प्रतिधारण नहीं।इस घटना को "हाइड्रोफोबिक चरण पतन" कहा जाता है (जैसा कि चित्र 1 के बाएं भाग में दिखाया गया है)।यद्यपि यह स्थिति तब प्रतिवर्ती होती है जब स्तंभ को मेथनॉल या एसीटोनिट्राइल जैसे कार्बनिक सॉल्वैंट्स से धोया जाता है, फिर भी यह स्तंभ को नुकसान पहुंचा सकता है।इसलिए इस स्थिति को होने से रोकना जरूरी है.
चित्र 1. नियमित C18 कॉलम (बाएं) और C18AQ कॉलम (दाएं) में सिलिका जेल की सतह पर बंधे चरणों का योजनाबद्ध आरेख।
उपर्युक्त समस्याओं के समाधान के लिए, क्रोमैटोग्राफ़िक पैकिंग सामग्री निर्माताओं ने तकनीकी सुधार किए हैं।इन सुधारों में से एक सिलिका मैट्रिक्स की सतह पर कुछ संशोधन करना है, जैसे कि सिलिका जेल की सतह को अधिक हाइड्रोफिलिक बनाने के लिए हाइड्रोफिलिक साइनो समूहों की शुरूआत (जैसा कि चित्र 1 के दाहिने हिस्से में दिखाया गया है)।इस प्रकार सिलिका सतह पर C18 श्रृंखलाओं को अत्यधिक जलीय परिस्थितियों में पूरी तरह से बढ़ाया जा सकता है और हाइड्रोफोबिक चरण के पतन से बचा जा सकता है।इन संशोधित C18 स्तंभों को जलीय C18 स्तंभ कहा जाता है, अर्थात् C18AQ स्तंभ, जो अत्यधिक जलीय निक्षालन स्थितियों के लिए डिज़ाइन किए गए हैं और 100% जलीय प्रणाली को सहन कर सकते हैं।C18AQ कॉलम को कार्बनिक अम्ल, पेप्टाइड्स, न्यूक्लियोसाइड और पानी में घुलनशील विटामिन सहित मजबूत ध्रुवीय यौगिकों के पृथक्करण और शुद्धिकरण में व्यापक रूप से लागू किया गया है।
नमूनों के लिए फ्लैश शुद्धि में डीसेल्टिंग C18AQ कॉलम के विशिष्ट अनुप्रयोगों में से एक है, जो बाद के अध्ययनों में नमूने के अनुप्रयोग को सुविधाजनक बनाने के लिए नमूना विलायक में नमक या बफर घटकों को हटा देता है।इस पोस्ट में, मजबूत ध्रुवीयता वाले ब्रिलियंट ब्लू एफसीएफ को नमूने के रूप में इस्तेमाल किया गया था और C18AQ कॉलम पर शुद्ध किया गया था।नमूना विलायक को बफर समाधान से कार्बनिक विलायक द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था, इस प्रकार निम्नलिखित रोटरी वाष्पीकरण की सुविधा के साथ-साथ सॉल्वैंट्स और परिचालन समय की बचत हुई।इसके अलावा, नमूने में कुछ अशुद्धियाँ हटाकर नमूने की शुद्धता में सुधार किया गया।
प्रायोगिक अनुभाग
चित्र 2. नमूने की रासायनिक संरचना।
इस पोस्ट में ब्रिलियंट ब्लू एफसीएफ को नमूने के रूप में इस्तेमाल किया गया था।कच्चे नमूने की शुद्धता 86% थी और नमूने की रासायनिक संरचना चित्र 2 में दिखाई गई थी। नमूना समाधान तैयार करने के लिए, ब्रिलियंट ब्लू एफसीएफ के 300 मिलीग्राम पाउडरयुक्त कच्चे ठोस को 1 एम NaH2PO4 बफर समाधान में घोल दिया गया और अच्छी तरह से हिलाया गया। एक पूर्णतः स्पष्ट समाधान.फिर नमूना समाधान को एक इंजेक्टर द्वारा फ़्लैश कॉलम में इंजेक्ट किया गया।फ़्लैश शुद्धिकरण का प्रायोगिक सेटअप तालिका 1 में सूचीबद्ध है।
| यंत्र | सेपाबीन™ मशीन2 | |||
| कारतूस | 12 ग्राम सेपाफ्लैश सी18 आरपी फ्लैश कार्ट्रिज (गोलाकार सिलिका, 20 - 45 μm, 100 Å, ऑर्डर संख्या: SW-5222-012-SP) | 12 ग्राम सेपाफ्लैश C18AQ आरपी फ्लैश कार्ट्रिज (गोलाकार सिलिका, 20 - 45 μm, 100 Å, ऑर्डर संख्या: SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| वेवलेंथ | 254 एनएम | |||
| मोबाइल फेज़ | विलायक ए: पानी विलायक बी: मेथनॉल | |||
| प्रवाह दर | 30 एमएल/मिनट | |||
| नमूना लोड हो रहा है | 300 मिलीग्राम (ब्रिलियंट ब्लू एफसीएफ 86% की शुद्धता के साथ) | |||
| ढाल | समय (सीवी) | विलायक बी (%) | समय (सीवी) | विलायक बी (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
परिणाम और चर्चा
नमूना डीसेल्टिंग और शुद्धिकरण के लिए एक सेपाफ्लैश C18AQ आरपी फ्लैश कार्ट्रिज का उपयोग किया गया था।स्टेप ग्रेडिएंट का उपयोग किया गया था जिसमें शुद्ध पानी का उपयोग रेफरेंस की शुरुआत में मोबाइल चरण के रूप में किया गया था और 10 कॉलम वॉल्यूम (सीवी) तक चलाया गया था।जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, मोबाइल चरण के रूप में शुद्ध पानी का उपयोग करते समय, नमूना पूरी तरह से फ्लैश कार्ट्रिज पर बरकरार रखा गया था।इसके बाद, मोबाइल चरण में मेथनॉल को सीधे 100% तक बढ़ा दिया गया और ग्रेडिएंट 7.5 सीवी तक बनाए रखा गया।नमूना 11.5 से 13.5 सीवी तक निकाला गया था।एकत्रित अंशों में, नमूना समाधान को NaH2PO4 बफर समाधान से मेथनॉल में बदल दिया गया था।अत्यधिक जलीय घोल की तुलना में, मेथनॉल को अगले चरण में रोटरी वाष्पीकरण द्वारा निकालना बहुत आसान था, जो निम्नलिखित शोध को सुविधाजनक बनाता है।
चित्र 3. C18AQ कार्ट्रिज पर नमूने का फ्लैश क्रोमैटोग्राम।
मजबूत ध्रुवता के नमूनों के लिए C18AQ कार्ट्रिज और नियमित C18 कार्ट्रिज के अवधारण व्यवहार की तुलना करने के लिए, समानांतर तुलना परीक्षण किया गया था।एक सेपाफ्लैश सी18 आरपी फ्लैश कार्ट्रिज का उपयोग किया गया था और नमूने के लिए फ्लैश क्रोमैटोग्राम चित्र 4 में दिखाया गया था। नियमित सी18 कार्ट्रिज के लिए, उच्चतम सहनशील जलीय चरण अनुपात लगभग 90% है।इसलिए शुरुआती ग्रेडिएंट को 90% पानी में 10% मेथनॉल पर सेट किया गया था।जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है, उच्च जलीय अनुपात के कारण C18 श्रृंखलाओं के हाइड्रोफोबिक चरण पतन के कारण, नमूना नियमित C18 कार्ट्रिज पर मुश्किल से बरकरार रखा गया था और मोबाइल चरण द्वारा सीधे बाहर निकाल दिया गया था।परिणामस्वरूप, नमूना अलवणीकरण या शुद्धिकरण का कार्य पूरा नहीं किया जा सकता है।
चित्र 4. नियमित C18 कार्ट्रिज पर नमूने का फ्लैश क्रोमैटोग्राम।
रैखिक ग्रेडिएंट की तुलना में, स्टेप ग्रेडिएंट के उपयोग के निम्नलिखित फायदे हैं:
1. नमूना शुद्धिकरण के लिए विलायक का उपयोग और संचालन समय कम हो गया है।
2. लक्ष्य उत्पाद एक तीव्र शिखर में उत्सर्जित होता है, जो एकत्रित अंशों की मात्रा को कम करता है और इस प्रकार निम्नलिखित रोटरी वाष्पीकरण की सुविधा के साथ-साथ समय की बचत भी करता है।
3. एकत्रित उत्पाद मेथनॉल में है जिसे वाष्पित करना आसान है, इस प्रकार सुखाने का समय कम हो जाता है।
निष्कर्ष में, नमूने के शुद्धिकरण के लिए जो अत्यधिक ध्रुवीय या अत्यधिक हाइड्रोफिलिक है, सेपाफ्लैश सी18एक्यू आरपी फ्लैश कार्ट्रिज प्रारंभिक फ्लैश क्रोमैटोग्राफी सिस्टम सेपाबीन™ मशीन के साथ मिलकर एक तेज और कुशल समाधान प्रदान कर सकता है।
सेपाफ्लैश बॉन्डेड सीरीज सी18 आरपी फ्लैश कार्ट्रिज के बारे में
सैंटाई टेक्नोलॉजी से भिन्न विशिष्टताओं के साथ सेपाफ्लैश C18AQ आरपी फ्लैश कार्ट्रिज की एक श्रृंखला है (जैसा कि तालिका 2 में दिखाया गया है)।
| आइटम नंबर | कॉलम का आकार | प्रवाह दर (एमएल/मिनट) | अधिकतम दबाव (पीएसआई/बार) |
| एसडब्ल्यू-5222-004-एसपी(एक्यू) | 5.4 ग्राम | 5-15 | 400/27.5 |
| एसडब्ल्यू-5222-012-एसपी(एक्यू) | 20 ग्राम | 10-25 | 400/27.5 |
| एसडब्ल्यू-5222-025-एसपी(एक्यू) | 33 ग्राम | 10-25 | 400/27.5 |
| एसडब्ल्यू-5222-040-एसपी(एक्यू) | 48 ग्राम | 15-30 | 400/27.5 |
| एसडब्ल्यू-5222-080-एसपी(एक्यू) | 105 ग्रा | 25-50 | 350/24.0 |
| एसडब्ल्यू-5222-120-एसपी(एक्यू) | 155 ग्राम | 30-60 | 300/20.7 |
| एसडब्ल्यू-5222-220-एसपी(एक्यू) | 300 ग्राम | 40-80 | 300/20.7 |
| एसडब्ल्यू-5222-330-एसपी(एक्यू) | 420 ग्राम | 40-80 | 250/17.2 |
तालिका 2. सेपाफ्लैश C18AQ आरपी फ़्लैश कार्ट्रिज।
पैकिंग सामग्री: उच्च दक्षता गोलाकार C18(AQ)-बंधित सिलिका, 20 - 45 μm, 100 Å।
लॉजी (जैसा कि तालिका 2 में दिखाया गया है)।
पोस्ट समय: अगस्त-27-2018